Каковы принципы экстракции и очистки нуклеиновых кислот?

Экстракция нуклеиновых кислот используется в молекулярно-биохимических тестах и ​​диагностике и является первым этапом клонирования, трансформации, ферментативного переваривания, транскрипции, амплификации и секвенирования in vitro. Однако из-за большого количества белков, углеводов, метаболитов и других загрязнителей В исходном образце нелегко извлечь высококачественные нуклеиновые кислоты. Необходимо применить вспомогательную систему экстракции нуклеиновых кислот и реагенты для экстракции нуклеиновых кислот, чтобы автоматически завершить экстракцию нуклеиновой кислоты образца.

Принципы экстракции и очистки нуклеиновых кислот
1. Следует гарантировать целостность первичной структуры нуклеиновой кислоты;
2. Устраните загрязнение от других молекул.
Для обеспечения изучения структуры и функции нуклеиновой кислоты наиболее важным требованием является полная первичная структура, поскольку вся генетическая информация хранится в первичной структуре, и первичная структура нуклеиновой кислоты также определяет форму ее высокого уровня. структура и другие биологические макромолекулы. Способ объединения. Очистка нуклеиновой кислоты должна соответствовать следующим трем требованиям:
1. Отсутствуют органические растворители и чрезмерно высокие концентрации ионов металлов, которые могут ингибировать ферменты в образцах нуклеиновых кислот;
2. Следует минимизировать загрязнение других биологических макромолекул, таких как белки, полисахариды и молекулы липидов;
3. Устранение загрязнения другими молекулами нуклеиновых кислот, например РНК должна удаляться при извлечении молекул ДНК, и наоборот.

Чтобы гарантировать целостность и чистоту выделенной нуклеиновой кислоты, во время эксперимента следует учитывать следующие моменты:
1. Постарайтесь упростить этапы работы и сократить процесс экстракции, чтобы уменьшить повреждение нуклеиновой кислоты различными вредными факторами;
2. Уменьшить деградацию нуклеиновых кислот химическими факторами. Чтобы избежать повреждения фосфодиэфирной связи в цепи нуклеиновой кислоты из-за избытка кислоты или основания, операция в основном проводится при pH 4-10;
3. Уменьшить разложение нуклеиновых кислот за счет физических факторов.Основным физическим фактором разложения является механическое усилие сдвига, за которым следует высокая температура.
Механическое усилие сдвига включает сильное и высокоскоростное встряхивание и перемешивание раствора, чтобы раствор быстро прошел через узкие и длинные поры, клетки внезапно помещаются в гипотонический раствор, клетки взрывоопасны, а образцы ДНК повторно замораживаются и хранятся. На эти рабочие детали следует обратить внимание в ходе экспериментальной операции.Основная опасность механического сдвига — это линейные молекулы ДНК с большой молекулярной массой, такие как хромосомная ДНК эукариотических клеток.
Угроза кольцевым молекулам ДНК с малым молекулярным весом, таким как молекулы плазмидной ДНК и РНК, относительно невелика. Высокая температура подобна кипению в течение длительного времени. Помимо силы сдвига, вызванной кипением воды, сама высокая температура также может повредить некоторые химические связи в молекулах нуклеиновых кислот. В процессе экстракции нуклеиновой кислоты он обычно работает при низкой температуре, но теперь обнаружено, что нет большой разницы в качестве нуклеиновой кислоты, полученной при комнатной температуре, быстрая экстракция и низкая температура экстракции.
4. Чтобы предотвратить биодеградацию нуклеиновых кислот, различные нуклеазы внутри или вне клетки переваривают фосфодиэфирную связь в цепи нуклеиновой кислоты и непосредственно разрушают первичную структуру нуклеиновой кислоты. Среди них ферменты ДНК требуют активации двухвалентных ионов металла Mg2. и Ca2. Использование ЭДТА и цитрата для хелатирования двухвалентных ионов металлов может в основном ингибировать активность ДНКазы. РНКаза не только широко распространена, легко загрязняет образец, но также устойчива к высокой температуре, кислоте, щелочам и ее нелегко инактивировать, поэтому основной фактор опасности в процессе извлечения биоразлагаемой РНК.
Основные этапы экстракции нуклеиновых кислот — это не что иное, как разрушение клеток, удаление белков, связанных с нуклеиновыми кислотами, полисахаридами, липидами и другими биологическими макромолекулами, удаление других нежелательных молекул нуклеиновых кислот, осаждение нуклеиновых кислот, удаление солей, органических растворителей и других примесей и очистка нуклеиновых кислот Подождите. Схема экстракции нуклеиновой кислоты должна быть определена в соответствии с характеристиками конкретного биологического материала и молекул нуклеиновых кислот, которые необходимо экстрагировать. Для молекул нуклеиновых кислот, обогащенных определенной органеллой, схема экстракции органелл заранее а затем извлечение целевой молекулы нуклеиновой кислоты может обеспечить полноту и молекулы нуклеиновой кислоты с высокой чистотой и высоким качеством.