Как выполнить экстракцию нуклеиновой кислоты
Общая трудность экстракции нуклеиновых кислот заключается в сложности извлечения высококачественной РНК из некоторых тканей растений, что связано с богатыми ингредиентами в этих тканях растений, такими как фенольные соединения, полисахариды и некоторые неопознанные вторичные метаболиты. Кроме того, есть ткани, которые богаты повышенной активностью. В интактной клетке эти вещества отделены от нуклеиновых кислот. После разрушения клетки эти вещества будут взаимодействовать с РНК.
Метод экстракции нуклеиновой кислоты:
1. Быстро инактивируйте эндогенную РНКазу, чтобы предотвратить деградацию РНК. Следующие 3 метода могут эффективно инактивировать эндогенную РНКазу:
1) Соберите образец с клеточным лизатом, содержащим хаотропные вещества (например, соль гуанидина), и немедленно гомогенизируйте.
2) Немедленно заморозьте образец жидким азотом. Стоит отметить, что кусочки ткани должны быть достаточно маленькими, чтобы их можно было заморозить в момент погружения в жидкий азот, чтобы обеспечить мгновенную инактивацию РНКазы.
3) Немедленно поместите образец в раствор для хранения образцов РНК, не содержащий азота. Это водный нетоксичный реагент для сбора, который может немедленно стабилизировать и защитить РНК в неповрежденных, незамороженных тканях и образцах клеток. Ключевым моментом является то, что срез образца ткани должен быть достаточно тонким (<0,5 см), чтобы он мог быстро проникнуть в тканевой блок до того, как РНКаза разрушит РНК.
2. Используйте правильные условия хранения клеток или тканей.
После мгновенного замораживания образца жидким азотом его следует хранить при -80 ° C, и его нельзя размораживать. Даже непродолжительное размораживание перед гомогенизацией в лизате, содержащем соль гуанидина, приведет к деградации и потере РНК. Мгновенно замороженные ткани следует измельчить в порошок при сверхнизкой температуре, а затем поместить в раствор для лизиса для гомогенизации.
3. Выберите хороший метод выделения РНК.
Может оказаться трудным выбрать многочисленные доступные методы выделения РНК. Текущий простой и безопасный метод — разделение столбцов. Например, его любят все за простоту в эксплуатации, короткое время и высокую чистоту. Он не требует ДНКазы для переваривания ДНК, что экономит время и позволяет избежать деградации РНК, тем самым увеличивая выход экстракции нуклеиновых кислот; По сравнению с разделением без использования колонок, он чисто удаляет белки и другие примеси, улучшает чистоту и очень подходит для клеток, тканей и обычных растений.
Сложнее выбрать экстракцию растительной нуклеиновой кислоты. На экстракцию РНК растений влияет содержание фенолов, полисахаридов, белковых примесей и вторичных метаболитов. Вы можете выбрать набор для экстракции полисахаридов и полифенолов общей РНК растений (нарцисс, перец, морковь, кукуруза, лилия, пшеница, томаты, цветная капуста, рапс и т. Д.) И наборы для экстракции общей растительной РНК (подходят для экстракции большинства растений, включая : яблоко, виноград, клубника, банан, лонган, личи, газон, сосна, кедр, белая береза, пурпурная шишка, колеус, пуансеттия, олеандр, фикус бенджамина, фиалка, роза, герань, ипомея и др.); Следует отметить, что кровь (включая сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, другие жидкости) извлечение нуклеиновых кислот ТРИЗОЛ и эритроциты Метод лизиса не эффективен. Лизат эритроцитов не содержит ингибиторов РНКаз. В этом процессе РНК легко разрушается. Рекомендуется использовать набор для экстракции общей РНК крови.
