Шаги и принципы экстракции нуклеиновых кислот методом магнитных шариков
С постоянным развитием биомедицины обновляется и технология экстракции нуклеиновых кислот. Экстракция нуклеиновых кислот с помощью магнитных гранул, как новый тип технологии экстракции нуклеиновых кислот, позволяет извлекать нуклеиновые кислоты с высокой производительностью и автоматизацией, удовлетворяя потребности современной биотехнологии. Кроме того, этапы метода магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот относительно просты, легки в эксплуатации и хорошо воспринимаются. Далее я поделюсь с вами этапами и принципами метода магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот.
Метод магнитных шариков для стадий экстракции нуклеиновых кислот
1. Добавьте 1 мл деионизированной воды в каждый флакон с 40 мг сухого порошка протеиназы К до конечной концентрации 40 мг / мл и добавьте 500 мкл деионизированной воды в каждый флакон с 20 мг сухого порошка протеиназы К до конечной концентрации 40 мг / мл. и перемешайте в перевернутом виде. Его можно полностью растворить один раз, и его можно хранить при 4 ℃ для кратковременного использования. Пожалуйста, храните его при -20 ℃ для длительного хранения. Повторное замораживание и оттаивание не должно превышать пяти раз.
2. Образец ткани измельчают в мелкий порошок с 10-30 мг жидкого азота, переносят в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, ресуспендируют в 200 мкл 1-кратного буфера PBS, а затем переходят к следующему этапу. Жидкая проба переходит непосредственно к следующему этапу.
3. Возьмите 500 мкл вирусного лизата VL и добавьте его в 1,5 мл центрифужную пробирку без ферментов, затем добавьте 25 мкл протеиназы K и 25 мкл вирусных магнитных шариков (перед добавлением хорошо встряхните), а затем добавьте 200 мкл сыворотки / плазмы / ткани. гомогенат образец, перемешайте на вортексе и хорошо перемешайте на водяной бане с температурой 55% в течение 20 минут, переворачивайте и перемешивайте в течение 10 секунд каждые 5 минут.
4. Выньте центрифужную пробирку без ферментов из водяной бани, поместите ее на магнитную подставку и намагничивайте в течение 90 секунд, чтобы полностью адсорбировать магнитные шарики. Используйте пипетку, чтобы аккуратно аспирировать и выбросить супернатант (будьте осторожны, чтобы не притягивать магнитные шарики на дне пробирки).
5. Снимите центрифужную пробирку с магнитной подставки, добавьте 700 мкл промывочного раствора BufferA, перемешайте пипеткой или встряхиванием в течение 30 секунд, чтобы ресуспендировать магнитные шарики, затем поместите центрифужную пробирку на магнитную подставку и намагнитите в течение 90S, чтобы сделать шарики. Полностью адсорбированный, осторожно аспирируйте супернатант и слейте его пипеткой.
6. Возьмите 700 мкл промывочного раствора BufferB, добавьте его в центрифужную пробирку, постарайтесь не сдуть магнитные шарики, а затем аспирируйте и слейте супернатант.
7. Добавьте 80 мкл буфера для элюции, снимите центрифужную пробирку и купите в водяной бане при 56 ° C в течение 5 минут. В течение этого периода встряхивайте 3-4 раза, чтобы элюировать нуклеиновую кислоту с магнитных шариков.
8. Поместите центрифужную пробирку на магнитную подставку и притяните ее магнитом в течение 60 секунд, перенесите жидкость в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, не содержащую ферментов, и перейдите непосредственно к последующему эксперименту или храните при -20 ° C.
Принцип метода магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот
Его принцип в основном основан на электростатическом взаимодействии, гидрофобном взаимодействии и взаимодействии водородных связей. ДНК / РНК в клетке или ткани высвобождается под действием лизата. В это время поверхностно-модифицированные суперпарамагнитные наномагнитные гранулы из диоксида кремния «специфически связываются» с нуклеиновой кислотой с образованием «комплекса нуклеиновая кислота-магнитная гранула». Затем под действием внешнего магнитного поля комплекс отделяется. Затем элюат используется для вымывания неспецифически адсорбированных примесей, обессоливания и очистки для получения экстрагируемого вещества нуклеиновой кислоты.
