método de aislamiento y purificación de ácidos nucleicos
El ácido nucleico es un importante portador de información genética y una importante molécula de información biológica. Desempeña un papel clave en el proceso de investigación biológica de las personas. En la actualidad, existen muchos métodos para el aislamiento y purificación de ácidos nucleicos. El más utilizado es el tiocianato de (iso) guanidina. ¿Cuál es el método de fenol-cloroformo en un solo paso? Este método se presenta brevemente a continuación.
Debido a la influencia de la ARNasa, para obtener una molécula de ARN completa, es necesario inactivar la actividad de la ARNasa intracelular lo más rápido posible en la etapa inicial de aislamiento y purificación de ácidos nucleicos. Bajo el efecto sinérgico del β-mercapto Z. alcohol, el tiocianato de (iso) guanidina de alta concentración puede inhibir la actividad de la ARNasa de manera extremadamente rápida y puede aislar moléculas completas de ARN del páncreas y otras células de tejido ricas en ARNasa. reactivo usado. Para muestras con menor contenido, agregar glucógeno puede aumentar la tasa de recuperación de ARN. El método de un solo paso se usa con mayor frecuencia en la extracción de ARN total.
1, Método de un solo paso con tiocianato de (iso) guanidina y cloroformo
El método de (iso) guanidina tiocianato-fenol cloroformo es un método clásico de un solo paso, propuesto por Chomczynski y Sacchi en 1987. Se lisan las células con una solución desnaturalizante que contiene 4 mmol / L de tiocianato de (iso) guanidina y 0,1 mmol / L de β- mercaptoetanol, luego se extrae la solución de lisis con fenol / cloroformo en condiciones ácidas de pH 4.0, y finalmente se prepara ARN por precipitación con isopropanol y lavado con etanol al 75%. En comparación con el método anterior de ultracentrifugación de tiocianato de (iso) guanidina-CsCl, este método es simple, económico y eficiente, y puede manejar múltiples al mismo tiempo. Las muestras y la integridad y pureza del ARN son altas. Todavía se usa para el aislamiento y purificación de ácidos nucleicos de células cultivadas y la mayoría de tejidos animales.
El rendimiento de ARN total depende de la cantidad inicial de la muestra. El rendimiento de ARN total por miligramo de tejido es de aproximadamente 4-7 gy aproximadamente 5-10 g por 106 células. Sin embargo, este método no es adecuado para extraer ARN del tejido adiposo rico en triglicéridos y, en ocasiones, el ARN se contaminará con polisacáridos y proteoglicanos. Estas contaminaciones afectarán la disolución del ARN después de la precipitación con etanol, mientras que inhiben la reacción de RT-PCR. Afecta al paso de transferencia en la hibridación del ARN al unirse a la membrana. La extracción de ARN del tejido adiposo se puede reemplazar por el método de ultracentrifugación de tiocianato de (iso) guanidina-CsC1. Cuando la contaminación de polisacáridos y proteoglicanos es grave, el siguiente método puede eliminarse agregando un paso de extracción con solvente orgánico y cambiando las condiciones de precipitación del ARN.
2, método de un solo paso que puede preparar ARN, ADN y proteínas al mismo tiempo
Este método es un método mejorado del método de un solo paso con tiocianato de (iso) guanidina y cloroformo de fenol. Utiliza reactivo de lisis monofásico tiocianato-fenol de (iso) guanidina para lisar las células, y luego se agrega cloroformo para formar dos fases. El ADN y la proteína desnaturalizados se encuentran en la interfaz de las dos fases, y el ARN retenido en la fase acuosa superior se prepara mediante precipitación con isopropanol y lavado con alcohol Z al 75% en la solución de precipitación de ARN. La composición de la solución de precipitación de ARN es 1,2 mmol / L de NaCl y 0,8 mmol / L de citrato disódico.
Debido al uso de la solución de precipitación de ARN, las muestras de ARN preparadas por este método rara vez están contaminadas con polisacáridos y proteoglicanos, y pueden usarse para purificación de ARNm, hibridación Northern, transcripción inversa y reacciones RT-PCR. El ADN y la proteína en la interfaz se pueden precipitar por separado con etanol e isopropanol. El ADN preparado mediante este método tiene un tamaño de aproximadamente 20 kb y se puede utilizar como plantilla para reacciones de PCR, mientras que las muestras de proteínas se utilizan principalmente para transferencia Western. En la actualidad, este método tiene una variedad de reactivos de lisis monofásicos disponibles comercialmente para elegir. Es el método más comúnmente utilizado para la extracción de ARN total, y su rendimiento es equivalente al método de un solo paso con tiocianato de (iso) guanidina-fenol cloroformo.
3, otros métodos
El aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos son numerosos, como el método de LiC1-urea, el método de ultracentrifugación de tiocianato de (iso) guanidina-CsCl, el método de fenol térmico, el método de clorhidrato de guanidina-disolvente orgánico, etc., que ahora rara vez se utilizan debido a varias razones.
En la actualidad, Ascend ha formado un programa profesional de purificación automática de ácidos nucleicos que cubre una variedad de muestras biológicas.
