Resumen de los métodos de separación y purificación de ácidos nucleicos
Con el reciente repunte de la epidemia mundial, las pruebas de ácido nucleico se han convertido en la forma principal de detectar virus y también han profundizado la comprensión de todos sobre los ácidos nucleicos. De hecho, la separación y purificación del ácido nucleico es el problema principal que debe resolverse en la investigación de ingeniería genética o de proteínas. Es el paso básico para iniciar otras actividades posteriores (como secuenciación, amplificación, hibridación, ligación, clonación y detección biológica) y es un experimento moderno de detección biológica. Los medios básicos de la tecnología. Hay muchos métodos de uso común para la extracción de ADN. Aquí presentamos principalmente el método de extracción con fenol-cloroformo, el método de precipitación con alto contenido de sal y el método de adsorción con medio de sílice.
El método de extracción con fenol-cloroformo utiliza reactivos fenólicos como desnaturalizantes de proteínas. La muestra se lisa primero, luego se extrae (fenol / cloroformo) y luego se precipita (etanol absoluto). El papel del cloroformo es eliminar el exceso de fenol y promover la separación de las fases acuosa y orgánica. El método de extracción requiere centrifugación múltiple y los pasos son complicados y fáciles de causar contaminación cruzada. Además, debido a la adición de disolventes orgánicos como benceno / cloroformo, habrá residuos en el producto final, que afectarán las aplicaciones posteriores posteriores del ADN genómico.
El método de precipitación con alto contenido de sal elimina las impurezas de las proteínas y separa el ADN mediante la adición de varias proteasas. Este método elimina eficazmente la contaminación de los reactivos y el ADN extraído tiene un mayor rendimiento y una mayor pureza, pero la desventaja es que el proceso de digestión de la proteasa lleva más tiempo.
La adsorción por medio de silicio es la deshidratación del esqueleto del fosfodiéster en la molécula de ADN bajo la acción de la sal caotrópica, de modo que el grupo ácido fosfórico queda expuesto y al mismo tiempo se adsorbe reversiblemente al gel de sílice. La fuerza electrostática y el enlace de hidrógeno juegan un papel clave en la adsorción de gel de sílice y ácido nucleico. Este método tiene ciertas limitaciones en la longitud de la cadena del ácido desoxirribonucleico, y los fragmentos de ADN más pequeños (<100 pb) no son fáciles de adsorber eficazmente en el medio. El método de purificación por adsorción de medio de sílice permite que el lisado pase a través de la membrana del filtro mediante centrifugación y presión de vacío, lo que puede extraer de forma eficaz trazas de ADN.
Los tres métodos anteriores tienen requisitos relativamente estrictos sobre la capacidad de operación personal del experimentador debido al engorroso proceso, el alto costo de tiempo y la adición de reactivos dañinos. Todo esto hace que sea imposible lograr una extracción de ADN de alta pureza, alto rendimiento y automatizada, especialmente para el proceso de purificación de muestras grandes. Tomando como ejemplo el establecimiento de un banco de muestras de genes, la carga de trabajo es relativamente grande, el período de tiempo requerido es relativamente largo y el presupuesto del proyecto es relativamente grande.
La extracción magnética en fase sólida (MSPE) ha atraído mucha atención en el pretratamiento de muestras biológicas. La capacidad de los materiales magnéticos para unirse al objetivo es la clave para el pretratamiento de la muestra. Como alternativa a los métodos de extracción tradicionales, MSPE se ha utilizado cada vez más para extraer ADN genómico de bacterias o lisados celulares debido a su rápido tiempo de procesamiento, requisitos reducidos de solventes orgánicos y facilidad de implementación, y es adecuado para diversas muestras biológicas de extracción de ADN (como bacterias, virus, semen, saliva, orina, plantas, etc.).
Primero, el material magnético se combina con el objetivo después de una determinada operación (adsorción); luego, se aplica un cierto campo magnético al material magnético para separarlo efectivamente de la solución de muestra y eliminar las impurezas; finalmente, seleccione los reactivos apropiados. El objetivo se eluye en la superficie del material.
MSPE tiene muchas ventajas en la separación y purificación de muestras biológicas: los pasos del método son relativamente simples; evita la destrucción de proteínas, ácidos nucleicos y otras sustancias; puede operar directamente sobre muestras biológicas existentes sin agregar otras operaciones; se puede utilizar repetidamente en determinadas circunstancias.
