метод выделения и очистки нуклеиновых кислот
Нуклеиновая кислота — важный носитель генетической информации и важная молекула биологической информации. Он играет ключевую роль в процессе биологических исследований людей. В настоящее время существует множество методов выделения и очистки нуклеиновых кислот. Чаще всего используется тиоцианат (изо) гуанидина. Что представляет собой одностадийный метод фенол-хлороформа, этот метод кратко представлен ниже.
Из-за влияния РНКазы, чтобы получить полную молекулу РНК, необходимо как можно быстрее инактивировать активность внутриклеточной РНКазы на начальном этапе выделения и очистки нуклеиновой кислоты. Под синергическим эффектом β-меркапто-Z. спирта высокая концентрация (изо) гуанидинтиоцианата может чрезвычайно и быстро ингибировать активность РНКазы и может изолировать полные молекулы РНК из поджелудочной железы и других тканевых клеток, богатых РНКазами. использованный реагент. Для образцов с более низким содержанием добавление гликогена может увеличить скорость восстановления РНК. Одноэтапный метод чаще всего используется при экстракции тотальной РНК.
1. (Изо) гуанидинтиоцианат и хлороформ, одностадийный метод
Метод (изо) гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформ представляет собой классический одностадийный метод, предложенный Хомчински и Сакки в 1987 году. Он лизирует клетки денатурирующим раствором, содержащим 4 ммоль / л тиоцианата (изо) гуанидина и 0,1 ммоль / л β- меркаптоэтанол, затем раствор для лизиса экстрагируют фенолом / хлороформом в кислых условиях pH 4,0, и, наконец, получают РНК путем осаждения изопропанолом и промывки 75% этанолом. По сравнению с предыдущим методом ультрацентрифугирования (изо) тиоцианат-CsCl (изо) гуанидин-тиоцианат, этот метод прост, экономичен и эффективен, и может одновременно обрабатывать несколько. Образцы, а также целостность и чистота РНК высоки. Он до сих пор используется для выделения и очистки нуклеиновых кислот из культивируемых клеток и большинства тканей животных.
Выход общей РНК зависит от исходного количества образца. Выход общей РНК на миллиграмм ткани составляет около 4-7 г и около 5-10 г на 106 клеток. Однако этот метод не подходит для извлечения РНК из жировой ткани, богатой триглицеридами, и иногда РНК будет загрязнена полисахаридами и протеогликанами. Эти загрязнения будут влиять на растворение РНК после осаждения этанолом, ингибируя реакцию RT-PCR. Он влияет на стадию блоттинга при гибридизации РНК, связываясь с мембраной. Экстракцию РНК жировой ткани можно заменить методом ультрацентрифугирования (изо) гуанидин тиоцианат-CsC1. Когда загрязнение полисахаридами и протеогликанами является серьезным, следующий метод может быть устранен путем добавления стадии экстракции органическим растворителем и изменения условий осаждения РНК.
2, одноэтапный метод, который может одновременно готовить РНК, ДНК и белок
Этот метод является улучшенным одностадийным методом (изо) гуанидин тиоцианат-фенол хлороформ. В нем используется однофазный лизисный реагент (изо) тиоцианат-фенол (изо) гуанидин-тиоцианат-фенол для лизиса клеток, а затем добавляется хлороформ для образования двух фаз. Денатурированная ДНК и белок расположены на границе раздела двух фаз, и РНК, оставшаяся в верхней водной фазе, получают путем осаждения изопропанолом и промывки 75% Z-спиртом в растворе для осаждения РНК. Состав раствора для осаждения РНК: 1,2 ммоль / л NaCl и 0,8 ммоль / л цитрата динатрия.
Из-за использования раствора для осаждения РНК образцы РНК, полученные этим методом, редко бывают загрязнены полисахаридами и протеогликанами и могут использоваться для очистки мРНК, гибридизации по Нозерн, обратной транскрипции и реакций RT-PCR. ДНК и белок на границе раздела можно осаждать отдельно этанолом и изопропанолом. ДНК, полученная этим методом, имеет размер около 20 т.п.н. и может использоваться в качестве матрицы для реакций ПЦР, в то время как образцы белков в основном используются для вестерн-блоттинга. В настоящее время этот метод позволяет выбирать из множества имеющихся в продаже реагентов для однофазного лизиса. Это наиболее часто используемый метод экстракции тотальной РНК, и его выход эквивалентен одностадийному методу (изо) гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформ.
3, другие методы
Существует множество способов выделения и очистки нуклеиновых кислот, таких как метод LiC1-мочевины, метод ультрацентрифугирования (изо) тиоцианата (изо) гуанидин-тиоцианат-CsCl, метод термического фенола, метод гидрохлорида гуанидина с органическим растворителем и т. Д., Которые в настоящее время редко используются по разным причинам.
В настоящее время Ascend разработала профессиональную программу автоматической очистки нуклеиновых кислот, охватывающую множество биологических образцов.
