Краткое изложение методов разделения и очистки нуклеиновых кислот
С недавним откатом глобальной эпидемии тестирование нуклеиновых кислот стало основным способом обнаружения вирусов, а также углубило понимание нуклеиновых кислот всеми. Фактически, разделение и очистка нуклеиновой кислоты — это основная проблема, которую необходимо решить в генной инженерии или исследованиях в области белковой инженерии. Это основной шаг для инициирования других последующих действий (таких как секвенирование, амплификация, гибридизация, лигирование, клонирование и биологическое обнаружение) и современный эксперимент по биологическому обнаружению. Основные средства техники. Есть много широко используемых методов выделения ДНК. Здесь мы в основном представляем метод экстракции фенол-хлороформ, метод осаждения с высоким содержанием соли и метод адсорбции в среде диоксида кремния.
Метод экстракции фенол-хлороформ использует фенольные реагенты в качестве денатурирующих белков. Образец сначала лизируют, затем экстрагируют (фенол / хлороформ), а затем осаждают (абсолютный этанол). Роль хлороформа состоит в том, чтобы удалить избыток фенола и способствовать разделению водной и органической фаз. Метод экстракции требует многократного центрифугирования, а этапы сложны и легко вызывают перекрестное загрязнение. Кроме того, из-за добавления органических растворителей, таких как бензол / хлороформ, в конечном продукте будут оставаться остатки, которые повлияют на последующие последующие применения геномной ДНК.
Метод осаждения с высоким содержанием соли удаляет белковые примеси и разделяет ДНК путем добавления различных протеаз. Этот метод эффективно устраняет загрязнение реагентов, и экстрагированная ДНК имеет больший выход и более высокую чистоту, но недостатком является то, что процесс переваривания протеазы занимает больше времени.
Адсорбция кремниевой среды — это дегидратация фосфодиэфирного скелета в молекуле ДНК под действием хаотропной соли, так что группа фосфорной кислоты подвергается воздействию и в то же время обратимо адсорбируется на силикагеле. Электростатическая сила и водородная связь играют ключевую роль в адсорбции силикагеля и нуклеиновой кислоты. Этот метод имеет определенные ограничения на длину цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты, а меньшие фрагменты ДНК (<100 п.н.) нелегко эффективно адсорбировать на среде. Метод очистки с помощью адсорбции кремнеземной среды позволяет лизату проходить через мембрану фильтра за счет центрифугирования и вакуума, что позволяет эффективно извлекать следовые количества ДНК.
Вышеупомянутые три метода предъявляют относительно строгие требования к возможностям индивидуальной работы экспериментатора из-за громоздкости процесса, высоких временных затрат и добавления вредных реагентов. Все это делает невозможным достижение высокой чистоты, высокой отдачи и автоматизированного извлечения ДНК, особенно для процесса очистки больших образцов. Если взять в качестве примера создание банка образцов генов, рабочая нагрузка относительно велика, требуемый период времени относительно велик, а бюджет проекта относительно велик.
Магнитная твердофазная экстракция (MSPE) привлекает большое внимание при предварительной обработке биологических образцов. Способность магнитных материалов связываться с мишенью является ключом к предварительной обработке образцов. В качестве альтернативы традиционным методам экстракции MSPE все чаще используется для извлечения геномной ДНК из бактерий или клеточных лизатов благодаря быстрому времени обработки, меньшим требованиям к органическим растворителям и простоте реализации, а также подходит для экстракции ДНК из различных биологических образцов (таких как бактерии, вирусы, сперма, слюна, моча, растения и т. д.).
Во-первых, магнитный материал совмещается с мишенью после определенной операции (адсорбции); затем к магнитному материалу прикладывают определенное магнитное поле, чтобы эффективно отделить его от раствора образца и удалить примеси; наконец, выберите подходящие реагенты. Мишень элюируется на поверхность материала.
MSPE имеет много преимуществ при разделении и очистке биологических образцов: этапы метода относительно просты; избегает разрушения белков, нуклеиновых кислот и других веществ; он может напрямую воздействовать на существующие биологические образцы без добавления других операций; его можно использовать повторно при определенных обстоятельствах.
