Las pruebas de laboratorio de enfermedades infecciosas más utilizadas incluyen cultivo microbiano, aislamiento de virus, pruebas de ácido nucleico y pruebas de anticuerpos. La prueba de ácido nucleico también es un método para detectar virus, que puede detectar infecciones antes. Se han realizado pruebas de ácido nucleico para hepatitis B, hepatitis C y sida en la práctica clínica, que pueden detectar la presencia de virus en la sangre antes de que se produzcan los anticuerpos. Para algunas enfermedades respiratorias, se pueden usar pruebas de ácido nucleico de frotis de garganta o secreciones respiratorias para determinar si están infectadas y si son contagiosas. La influenza estacional, la influenza aviar, las infecciones por coronavirus, etc., se pueden juzgar fácilmente si hay componentes virales en el tracto respiratorio superior mediante pruebas de frotis de garganta, para determinar si la persona examinada es una persona infectada. Entonces, ¿qué tan precisa es la detección de ácido nucleico?

En la actualidad, no existen estadísticas exactas de muestras grandes para probar la precisión de la detección de ácido nucleico, pero hay muchos factores que afectan la precisión, como la calidad de los reactivos de detección, el momento de la infección de la persona examinada (demasiado temprano o demasiado tarde reducirá la precisión), muestras La cooperación del examinado al tomar el material (una cooperación deficiente puede hacer que la muestra no se coloque en su lugar) y la competencia operativa del examinador, etc.

Si todos los aspectos de la detección de ácidos nucleicos son precisos, la precisión de la detección de ácidos nucleicos puede alcanzar más del 95% en condiciones ideales. Pero debido a varias razones, se producirán resultados falsos negativos. El llamado falso negativo significa que el examinado es de hecho una persona infectada, pero el resultado de la prueba de ácido nucleico es negativo, que es un falso negativo. Con la mejora de la tecnología, la tasa de precisión de varias instituciones médicas está mejorando rápidamente y la tasa de falsos negativos disminuye continuamente.

Además, para las personas que han tenido contacto cercano con casos confirmados o sospechosos, generalmente se requieren dos pruebas de ácido nucleico para excluirlos. Para las personas que han estado en áreas de alto riesgo del nuevo coronavirus, si tienen fiebre y síntomas respiratorios, una prueba de ácido nucleico negativa puede tener un falso negativo, por lo que se necesitan dos pruebas de ácido nucleico para descartar. Además, si el médico considera que una prueba de ácido nucleico es negativa y aún así no se puede descartar, la prueba de ácido nucleico debe volver a realizarse. A veces, el médico también recomendará una tomografía computarizada de tórax, análisis de sangre y pruebas de anticuerpos séricos para el nuevo coronavirus para determinar si está infectado.

Con el rápido desarrollo del diagnóstico genético, la detección de alimentos modificados genéticamente, la medicina personalizada, etc., la tecnología actual de extracción de ácidos nucleicos ya no puede satisfacer las necesidades de la biotecnología actual, y existe una necesidad urgente de un ácido nucleico automatizado y de alto rendimiento. método de extracción. En este contexto, surgió el método de perlas magnéticas para la extracción de ácidos nucleicos.

El uso de perlas magnéticas para la extracción de ADN es una de las áreas donde se maximiza su valor biológico. Los principales tipos de microesferas utilizadas incluyen perlas magnéticas de silanol y perlas oligo magnéticas. Las perlas magnéticas con grupos de superficie pueden unirse de forma específica y reversible a los ácidos nucleicos liberados en la muestra de prueba. Al mismo tiempo, la capacidad de respuesta magnética de las perlas magnéticas se utiliza para realizar el movimiento direccional y el enriquecimiento bajo la acción de un campo magnético externo, para realizar la separación y purificación del ácido nucleico. Las principales ventajas del método de perlas magnéticas para la extracción de ácidos nucleicos incluyen una operación simple y automatizada, una operación a gran escala y un tiempo corto.

1. ¿Qué es una cuenta magnética?

Las perlas magnéticas son un tipo de materiales especiales de nano-micrones. Su tamaño suele oscilar entre unas pocas décimas de unas pocas micras y unas pocas micras, que es sólo una décima a una décima parte del diámetro de un cabello humano, que no se puede observar a simple vista. Cuenta magnética individual. Son superparamagnéticos, pueden moverse rápidamente hacia un lado en un campo magnético, reunirse y volver rápidamente a un estado disperso después de eliminar el campo magnético.

La superficie de las perlas magnéticas utilizadas para la extracción de ácidos nucleicos tiene propiedades específicas. En determinadas condiciones, el ácido nucleico viral se puede adsorber en la superficie y, en otras condiciones, el ácido nucleico viral se puede liberar de la superficie para las etapas de detección posteriores.

2.el principio del método de perlas magnéticas de extracción de ácido nucleico

La unión de ácido nucleico a perlas magnéticas se basa principalmente en enlaces electrostáticos, hidrófobos y de hidrógeno. El ADN / ARN de la célula o tejido se libera bajo la acción de la solución de lisis. En este momento, las perlas nanomagnéticas de sílice superparamagnéticas modificadas en la superficie «se unen específicamente» con el ácido nucleico para formar un «complejo ácido nucleico-perlas magnéticas». Luego, bajo la acción de un campo magnético externo, el complejo se separa. Después de lavar el eluido para eliminar los depósitos adsorbidos de forma no específica, desalar y purificar, se obtiene la sustancia de ácido nucleico que se va a extraer.

De acuerdo con el mismo principio que la columna de rotación de membrana de gel de sílice, la superficie de las nanopartículas superparamagnéticas se modifica y modifica mediante nanotecnología para preparar perlas nanomagnéticas de sílice superparamagnéticas. Las perlas magnéticas pueden reconocer específicamente y unirse eficientemente con moléculas de ácido nucleico en la interfaz microscópica. Usando el superparamagnetismo de nanoesferas de sílice, bajo la acción de sales caotrópicas (clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, etc.) y un campo magnético externo, el ADN y el ADN se pueden separar de muestras como sangre, tejidos animales, alimentos y microorganismos patógenos. El ARN se puede utilizar en el diagnóstico de enfermedades clínicas, la seguridad de las transfusiones de sangre, la identificación forense, las pruebas microbiológicas ambientales, las pruebas de seguridad alimentaria, la investigación de biología molecular y otros campos.

De hecho, dado que las instituciones de análisis necesitan procesar una gran cantidad de muestras todos los días, la mayoría de los pasos de extracción de ácidos nucleicos se llevan a cabo mediante un instrumento automático de extracción de ácidos nucleicos con un kit de extracción de ácidos nucleicos con método de perlas magnéticas.

Con el continuo desarrollo de la biomedicina, también se está actualizando la tecnología de extracción de ácidos nucleicos. La extracción de ácidos nucleicos con perlas magnéticas, como un nuevo tipo de tecnología de extracción de ácidos nucleicos, puede extraer ácidos nucleicos con alto rendimiento y automatización, satisfaciendo las necesidades de la biotecnología actual. Además, los pasos del método de perlas magnéticas para la extracción de ácidos nucleicos son relativamente simples, fáciles de operar y son bien recibidos. A continuación, compartiré con ustedes los pasos y principios del método de perlas magnéticas para la extracción de ácidos nucleicos.

Método de perlas magnéticas para los pasos de extracción de ácidos nucleicos

1. Agregue 1 mL de agua desionizada a cada botella de 40 mg de polvo seco de proteinasa K hasta una concentración final de 40 mg / mL y agregue 500 μL de agua desionizada a cada botella de 20 mg de polvo seco de proteinasa K hasta una concentración final de 40 mg / mL. y mézclelo al revés. Se puede disolver completamente una vez y se puede almacenar a 4 ℃ para uso a corto plazo. Manténgalo a -20 ℃ para almacenamiento a largo plazo. La congelación y descongelación repetidas no debe exceder de cinco veces.

2. La muestra de tejido se muele hasta obtener un polvo fino con 10-30 mg de nitrógeno líquido, se transfiere a un tubo de centrífuga de 1,5 ml, se resuspende en 200 μL de tampón 1 X PBS y luego se pasa al siguiente paso. La muestra líquida pasa directamente al siguiente paso.

3. Tome 500 μL de lisado de virus VL y agréguelo a un tubo de centrífuga sin enzimas de 1,5 ml, luego agregue 25 μL de proteinasa K y 25 μL de perlas magnéticas virales (agite bien antes de agregar), y luego agregue 200 μL de suero / plasma / tejido homogeneizar la muestra, agitar y mezclar bien, baño maría al 55% C durante 20 minutos, invertir y mezclar durante 10 segundos cada 5 minutos.

4. Saque el tubo de centrífuga sin enzimas en el baño de agua, colóquelo en el soporte magnético y magnetice durante 90 segundos para absorber completamente las perlas magnéticas. Utilice una pipeta para aspirar y desechar con cuidado el sobrenadante (tenga cuidado de no atraer las perlas magnéticas en la parte inferior del tubo).

5. Retire el tubo de centrífuga del soporte magnético, agregue 700μL de solución de enjuague BufferA, mezcle pipeteando o agitando durante 30 segundos para resuspender las perlas magnéticas, luego coloque el tubo de centrífuga en el soporte magnético y magnetice durante 90 S para hacer las perlas Adsorbido por completo, aspirar con cuidado y desechar el sobrenadante con una pipeta.

6. Tome 700μL de solución de enjuague BufferB, agréguelo al tubo de centrífuga, trate de no soplar las perlas magnéticas y luego aspire y deseche directamente el sobrenadante.

7. Agregue 80μL de tampón de elución, retire el tubo de centrífuga y báñese en un baño de agua a 56 ° C durante 5 min. Durante este período, agite en vórtex 3-4 veces para eluir el ácido nucleico de las perlas magnéticas.

8. Coloque el tubo de centrífuga en el soporte magnético y atraiga magnéticamente durante 60 segundos, transfiera el líquido a un nuevo tubo de centrífuga sin enzimas de 1,5 ml y proceda directamente al experimento posterior o almacénelo a -20 ° C.

El principio del método de perlas magnéticas para la extracción de ácidos nucleicos.

Su principio se basa principalmente en la interacción electrostática, la interacción hidrófoba y la interacción de puentes de hidrógeno. El ADN / ARN de la célula o tejido se libera bajo la acción del lisado. En este momento, las perlas nanomagnéticas de sílice superparamagnéticas modificadas en la superficie «se unen específicamente» con el ácido nucleico para formar un «complejo ácido nucleico-perlas magnéticas». Luego, bajo la acción de un campo magnético externo, el complejo se separa. Luego, el eluido se usa para eliminar las impurezas adsorbidas de manera no específica, desalar y purificar para obtener la sustancia de ácido nucleico que se va a extraer.

Использование биологических магнитных шариков для извлечения нуклеиновой кислоты является новым методом экстракции нуклеиновой кислоты. По сравнению с традиционным методом экстракции хлороформом, изоамиловым спиртом и методом набора спин-колонок, этот метод все еще понятен многим людям. Есть также некоторые недоразумения в отношении процесс очистки нуклеиновых кислот жемчужным методом.

Недоразумение 1. Чем больше магнитных шариков, тем лучше эффект извлечения.

Некоторые люди думают, что при плохом эффекте экстракции увеличивают количество магнитных шариков. Они думают, что добавление немного большего количества магнитных шариков может привлечь больше нуклеиновых кислот. На самом деле эта идея не рекомендуется.
Основная особенность магнитных шариков заключается в том, что они могут быть диспергированы в жидкости или отделены от жидкой фазы в твердом состоянии под действием внешнего магнитного поля. Для любой системы реагентов отношение магнитных шариков к жидкости должно иметь определенное значение. значение, превышающее определенное соотношение. Избыточные магнитные шарики потеряют свои дисперсионные характеристики, потому что они не могут быть равномерно диспергированы в жидкости, а эффективность контакта между магнитными шариками нуклеиновой кислоты и жидкостью не может быть полностью увеличена во время процесса промывки.
Избыточные магнитные шарики также будут адсорбировать больше примесей, что имеет большое влияние на эффект удаления примесей. Даже иногда слишком много магнитных шариков адсорбируют протеазу, лизоцим и другие функциональные компоненты, которые играют важную роль в жидкой системе, что приводит к низкой эффективности всего набора. Во многих случаях, когда эффект экстракции плохой, уменьшение количества используемых магнитных шариков – лучший способ улучшить эффект экстракции.
Обычно количество эталонных магнитных шариков, выдаваемых набором для метода магнитных шариков, немного избыточно. Поэтому часто нет необходимости увеличивать количество магнитных шариков для повышения эффективности адсорбции. Однако, если определено, что количество магнитных шариков шариков недостаточно, эффект экстракции не очень хороший.Что ж, можно улучшить эффект экстракции, увеличив количество магнитных шариков в определенном диапазоне.

Заблуждение 2: чем больше используется реагентов, тем лучше эффект экстракции.

Однако для метода магнитных шариков каждое увеличение объема части жидкости снижает вероятность большего количества столкновений магнитных шариков, а уменьшение вероятности столкновений магнитных шариков приведет к значительному падению скорости адсорбции. Следовательно, во многих случаях, хотя добавление раствора для лизиса и промывочного раствора действительно может улучшить лизис и улучшить отмывку, суть экстракции магнитных гранул – это эффективность адсорбции нуклеиновых кислот магнитными гранулами.Эффективность столкновения магнитных гранул не может быть гарантирована, но эффективность экстракции нуклеиновой кислоты не может быть гарантирована.Да, поэтому простое увеличение количества реагентов, используемых для улучшения эффекта экстракции, может быть не полностью эффективным.

Недоразумение 3. Чем больше время стирки, тем лучше эффект отжима.

Если в экстрагированной нуклеиновой кислоте слишком много примесей, пользователь может подумать о промывке несколько раз, чтобы получить более чистую нуклеиновую кислоту. Увеличение количества промывок действительно способствует очистке нуклеиновых кислот, но, учитывая, что каждая промывка будет терять определенное количество нуклеиновой кислоты и увеличивать вероятность фрагментации и гидролиза нуклеиновой кислоты, обычно целесообразно контролировать количество промывок на От 2 до 4 раз.

Заблуждение 4: чем больше образцов используется, тем лучше эффект извлечения.

Когда образец недостаточно свежий или само содержание нуклеиновой кислоты низкое, эффект экстракции нуклеиновой кислоты часто бывает плохим, и многие учителя будут использовать несколько образцов для увеличения количества экстракции нуклеиновой кислоты.
Однако простое увеличение объема отбора пробы может иногда привести к появлению слишком большого количества примесей, превышающих лизирующую способность лизата, а также к снижению эффективности экстракции. Поэтому не рекомендуется просто увеличивать объем отбора пробы для достижения цели увеличения объем извлечения.
Если объем экстракции действительно слишком мал из-за недостаточного объема пробы, рекомендуется перед началом экстракции пройти этап обогащения или концентрирования. Или увеличение полноты лизиса и раскрытие большего количества нуклеиновых кислот также является решением.

Недоразумение 5. Если определенный вид магнитного шарика хорош, он должен быть эффективным во всех тестах.

Существует много типов магнитных шариков, разный размер частиц, разная дисперсия, разное время магнитного отклика, разная основная матрица покрытия, разная внешняя модифицированная функциональная группа, разная плотность покрытия, разная длина плеча функциональной группы, что приводит к появлению магнитных шариков. .
Следовательно, эксперименты и системы, к которым приспосабливаются разные магнитные шарики, также различны. Так же, как реагенты для экстракции нуклеиновых кислот, формулы не совсем такие же, и свойства магнитных шариков, которые также используются для экстракции нуклеиновых кислот, не совсем такие же.
Некоторые магнитные шарики показывают более высокую эффективность адсорбции при экстракции постоянной нуклеиновой кислоты, а некоторые магнитные шарики более подходят для экстракции следов нуклеиновой кислоты. Некоторые магнитные шарики подходят для более кислых систем реагентов, а некоторые магнитные шарики подходят для более щелочных систем реагентов. Некоторые магнитные шарики имеют хорошую магнитную чувствительность, но высокую скорость оседания, что больше подходит для автоматического экстрактора с магнитным стержнем; некоторые магнитные шарики имеют медленную скорость оседания, но с большим временем магнитного отклика и больше подходят для автоматического экстрактора пипеточного типа.
Редко бывает что-то вроде магнитных шариков, которые можно применить во всех экспериментальных ситуациях. За исключением фиксированного набора, в большинстве случаев магнитные шарики и систему реагентов необходимо регулировать в течение определенного периода времени.

Непонимание 6. Нехорошо сравнивать с определенным комплектом, то есть магнитные бусины не годятся.

В процессе проверки магнитных шариков многие клиенты просто заменяют магнитные шарики на такое же количество под зрелой системой реагентов, чтобы сравнить эффекты магнитных шариков.
Таким образом, легко сделать вывод, что определенные магнитные шарики неэффективны, но на самом деле, поскольку разные магнитные шарики подходят для разных систем и дозировок, их часто необходимо отрегулировать для получения лучших результатов экстракции.

El kit de extracción de ácidos nucleicos es un producto de alta tecnología que combina la ciencia biológica y la ciencia de los nanomateriales. Es un gran avance en la tecnología de extracción y purificación de ácidos nucleicos. Con el rápido desarrollo del diagnóstico genético, la detección de alimentos modificados genéticamente, la medicina personalizada, etc., la tecnología actual de extracción de ácidos nucleicos ya no puede satisfacer las necesidades de la biotecnología actual, y existe una necesidad urgente de un ácido nucleico automatizado y de alto rendimiento. método de extracción. En este contexto, se creó un kit de extracción de ácidos nucleicos (método de perlas magnéticas). A continuación, el editor de Aisen te presentará cuáles son los componentes principales del kit de extracción de ácidos nucleicos.

1, lauril sulfato de sodio

El lauril sulfato de sodio es una materia orgánica, polvo blanco o amarillo claro, soluble en agua, insensible a los álcalis y al agua dura. Tiene descontaminación, emulsificación y excelente poder espumante. Es un tensioactivo aniónico ligeramente tóxico para el cuerpo humano y su biodegradabilidad es> 90%.

Puede romper los enlaces de hidrógeno en y entre las moléculas, desplegar las moléculas, destruir la estructura secundaria y terciaria de las moléculas de proteína, desnaturalizar la proteína y destruir la unión de proteína y ácido nucleico a alta temperatura y promover la liberación de ácido nucleico.

2, etil fenil polietilenglicol

El etilfenil polietilenglicol se abrevia como NP-40, que es un detergente no iónico muy suave, que se usa a menudo en lisis celular, tratamiento de proteínas, tratamiento histoquímico, lavado híbrido, etc. el daño a la membrana nuclear es débil.

3, resina quelante catiónica débil

La resina quelante de cationes débiles es una resina quelante química compuesta de copolímero de estireno y divinilbenceno, que contiene pares de iones iminodiacetato, que pueden quelar iones multivalentes, especialmente para iones metálicos de alta valencia. Muy alta afinidad y quelación. En condiciones de baja fuerza iónica, alcalinidad y ebullición, la membrana celular puede romperse y la proteína puede desnaturalizarse. Las partículas de Chelex se eliminan por centrifugación y el material unido se separa del ADN.

4, proteinasa K

es una poderosa enzima proteolítica aislada de Candida albicans. Tiene una alta actividad específica y es un reactivo clave para la extracción de ADN. En la extracción de ADN, la función principal es descomponer enzimáticamente las histonas unidas a los ácidos nucleicos, de modo que el ADN se libere en la solución.

5, polietilenglicol octil fenil éter

El octilfeniléter de polietilenglicol se abrevia como Triton X-100. Es un tensioactivo no iónico. No se disocia en agua, tiene una alta estabilidad en solución y no se ve afectado fácilmente por sales inorgánicas de electrolitos fuertes. Se combina con lípidos como fosfolípidos en membranas biológicas para formar complejos solubles; el extremo hidrófobo también puede combinarse con las regiones hidrófobas de las proteínas de membrana para formar complejos y disolverse en solución.

6, isotiocianato de guanidina

El isotiocianato de guanidina es un potente desnaturalizante de proteínas, que puede disolver las proteínas rápidamente y provocar la rotura de la estructura celular. La nucleoproteína se separa rápidamente del ácido nucleico debido a la destrucción y desaparición de su estructura secundaria.

7, ácido etilendiaminotetraacético

El ácido etilendiaminotetraacético es un compuesto orgánico, que es un polvo blanco a temperatura y presión normales. Es un agente quelante que puede unirse a iones metálicos divalentes. Dado que la mayoría de las nucleasas y algunas proteasas requieren iones metálicos divalentes, a menudo se utilizan como inhibidores de nucleasas y proteasas; también se pueden utilizar para eliminar el efecto inhibidor de los iones de metales pesados ​​sobre las enzimas.

Lo anterior es la introducción a los componentes principales del kit de extracción de ácidos nucleicos. El kit de extracción de ácido nucleico utiliza perlas magnéticas para adsorber ADN / ARN para lograr el propósito de una rápida purificación de ADN / ARN, y los componentes químicos mencionados anteriormente juegan un papel importante en este proceso. El kit de extracción de ácido nucleico con método de perlas magnéticas diseñado y producido por Aisen Biotechnology es de calidad confiable, cómodo de usar y de excelente efecto. Los clientes que lo necesiten pueden llamar para realizar consultas.