使用生物磁珠提取核酸，在国内还属于较为新颖的核酸提取方式，相比于传统的氯仿异戊醇抽提法和离心柱试剂盒法，这种方法还有很多人不慎了解，在使用磁珠法提纯核酸的过程中，也存在着一些误区。

误区一：磁珠使用的越多，提取效果越好

有很多老师喜欢在提取效果不佳的时候，增加磁珠的用量，认为磁珠多加一点，就能吸上更多的核酸，不得不说这种想法是不可取的。

磁珠的主要特点是既可以分散于液体中，也可以在外加磁场作用下以固态方式和液相分离，任何试剂体系，磁珠和液体的比例都应该是有一定阈值的，超过一定的比例，过多的磁珠将因为无法均匀分散于液体中，而丧失其分散的特性，也使得洗涤过程中无法充分增加核酸磁珠和液体接触的效率。而过量的磁珠也会吸附更多的杂质，对于除杂的效果影响非常大。甚至有些时候，过多的磁珠会吸附蛋白酶、溶菌酶等在液体体系中起主要作用的功能成分，导致整个试剂盒效率低下。有很多时候，在提取效果不佳的时候，减少磁珠使用量，反而是提升提取效果的最优途径。

通常情况下，磁珠法试剂盒给出的参考磁珠用量都是略微过量的，因此需要增加磁珠用量改善吸附效率的情况并不多，但如果确定是磁珠用量不足导致的提取效果不好，是可以在一定范围内通过增加磁珠用量来改善提取效果的。

以GNT-02系列磁珠为例，在提取常量样本（植物组织，全血等）时，通常用量为10ul/次；在提取微量样本（如血清游离DNA，口腔拭子等）时，磁珠用量为15~20ul/次。如需超过这个使用量，需要和技术工程师进行沟通。

误区二：试剂使用的越多，提取效果越好

裂解效果不好？多加点裂解液。洗涤效果不好？多加点洗涤液。这是很多客户在使用试剂盒中的惯性思维。

但是对于磁珠法而言，每增加一部分液体体积，就减少了更多的磁珠碰撞几率，而降低磁珠碰撞几率，会导致吸附率的大幅度下降。所以很多时候，虽然增加裂解液和洗涤液确实能够起到增强裂解和增强洗涤的作用，但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率，无法保证磁珠碰撞效率是不能保证核酸提取效率的，所以单纯增加试剂使用量改善提取效果并不一定完全有效。

对于GNT-B02全血基因组DNA试剂盒而言，一般裂解液使用量不应超过400ul/次，洗涤液使用量不应超过500ul/次。如果确实需要放大体系，磁珠和样本用量也应该相应增加，这种放大不一定是等比例的。

误区三：洗涤次数越多，提取效果越好

提取得到的核酸杂质过多时，使用者会考虑多进行几次洗涤，以得到更为纯净的核酸。增加洗涤次数确实有利于提纯核酸，但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸，且增加了核酸断裂水解的可能性，所以一般来说洗涤次数控制在2~4次为宜。

GNT系列的试剂盒，单一纯化类试剂盒的洗涤次数为2次，植物、动物类试剂盒的洗涤次数为3次，血液类试剂盒洗涤次数为3~4次。

误区四：样本取用的越多，提取效果越好

在样本不够新鲜或者核酸含量本身就很少的情况下，往往核酸提取效果不好，很多老师就会采用多取样本的方式增加核酸提取量。

但简单地增加样本取样量，有时会引入过多的杂质，超出裂解液裂解能力，也会使提取效率降低，所以并不推荐通过简单的增加样本取样量的方式来达到增加提取量的目的。

如果确实是由于样本量不足而引起的提取量过低，建议在前处理先经过富集或者浓缩步骤再开始提取。或者增加裂解的完全性，使更多的核酸暴露出来也是一种解决方法。

误区五：某一种磁珠好，就应该在所有试验中效果都好

磁珠的种类是多种多样的，粒径大小不同，分散性不同，磁响应时间不同，包被基础基质不同，外层修饰官能团不同，包被密度不同，官能团臂长不同，会导致磁珠特性千差万别。

所以不同磁珠所适应的实验和体系也是不同的。就像同样是核酸提取的试剂，配方也并不完全相同，同样应用于核酸提取的磁珠，性质也并非完全一致。

有的磁珠在常量核酸提取中表现出了更高的吸附效率，有的磁珠更适用于微量核酸提取。有的磁珠适合偏酸性系列的试剂体系，有的磁珠适合偏碱性系列的试剂体系。有的磁珠磁响应性好但是沉降速度快，更适合磁棒式自动提取仪；有的磁珠沉降速度慢但是磁响应时间长，更适合移液式自动提取仪。

很少有一种磁珠能适用于所有实验的情况，除了固定的试剂盒配合，多数情况下，磁珠和试剂体系都要做一定时间的配合调整。

误区六：和某种试剂盒对比效果不好，就是磁珠不好

很多客户在筛选磁珠过程中都是在已经成熟试剂体系下，简单地等量替换磁珠，用于比较磁珠效果。

这样就会很容易得出某种磁珠效果不好的结论，但实际上，由于不同磁珠适合的体系和用量是不同的，往往需要调整过后才能获得更好的提取效果。

体外诊断，是指在人体之外，通过对人体样本(血液、体液、组织等)进行检测而获取临床诊断信息，进而判断疾病或机体功能的产品和服务。

而检测人体样本的关键步骤之一，即是样本中的核酸（DNA和RNA）纯化。核酸纯化的方法是影响所提取核酸质量的重要因素，只有高质量的核酸才能满足下游的各种应用。

核酸是分子生物学的基础，而核酸提取是核酸检测，乃至于整个分子行业绕不过去的门槛，很多时候一份样本的核酸提取的好坏直接决定了检测结果的有效性。

核酸的基础知识

核酸分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），其中RNA又可以根据功能的不同分为核糖体RNA(r RNA)，信使RNA（m RNA）和转移RNA（t RNA）。

DNA主要集中在细胞核内，线粒体和叶绿体中，而RNA主要分布在细胞质当中。

为什么需要核酸提取？

核酸提取为大量广泛研究和应用提供了答案，获得的核酸可以多种方式进行应用。准确的研究目的，决定了要提取的核酸类型；核酸的应用往往影响提取方法的选择。为了确定最佳的研究方法，有必要清楚了解核酸的下游应用以及任何与样品类型相关的潜在限制。虽然依据样品类型，细胞裂解方式不同，但整体的核酸提取核心原则不变：细胞或组织样品裂解，去除非核酸污染物。

核酸提取纯化原则和要求

1、保证核酸一级结构的完整性

2、排除其它分子的污染（如提取DNA时排除RNA的干扰）

3、核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

4、其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度；

5、排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。

常见核酸提取纯化方法

1、苯酚氯仿抽提法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，变性降解核蛋白，使DNA从核蛋白中游离出来。而DNA易溶于水，却不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。利用萃取原理，根据蛋白核酸溶于不同的试剂层，将枪头伸入不同液层内抽取所需的成分，经多次洗涤后获得纯化核酸。

缺点是由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

优点是采用了实验室常见的试剂和药品，做起来成本比较低廉。

2、 离心柱纯化

此种方法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜，在高盐环境下，这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可被吸附在离心柱上，而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离。

但即便如此，离心柱纯化法仍存在缺点：

（1）高度依赖吸附膜的结合能力；

（2）洗脱不完全导致核酸流失；

（3）无法大量提取核酸。

3、磁珠法核酸分离技术

携带正电荷的磁珠易于吸附负电荷的核酸，主要用于从人血清或血浆样品中提取DNA 和RNA。一般而言，将样品与结合缓冲液和磁珠混合，核酸与磁珠结合后，经过数次洗涤与磁场捕获，洗脱下来的核酸即可通过PCR 或其它特定方法来检测特定的DNA或RNA。磁分离法也是广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。

不同类型基因检测均会涉及到核酸的提取和纯化步骤。核酸提取纯化的方法中，液体法和离心柱法均会涉及到有毒有机物的使用，对环境和实验操作者均存在一定的危害。而磁珠法需要相应特殊配制的磁珠缓冲液和特异修饰后的磁珠，从成本和操作方面来分析，均存在成本高且操作步骤繁琐，同时，也限制了自动化的进程和应用的推广。因此，开发一种能快速释放核酸并且对后续基因检测实验无影响核酸快速释放方法成为目前亟待解决的问题。

4、基因核酸快速释放技术

DNA释放试剂盒，专用于从各种常见的样品中快速释放恒温荧光扩增的 DNA，具有以下特点：

核酸释放剂可以快速裂解样品，使样品的 DNA 游离在溶液中。无需自备任何试剂，不使用苯酚、氯仿等有毒试剂。

操作简单，只用一步（约 3min）即可得到用于恒温荧光扩增的 DNA 模板，不需要任何离心、抽提等操作步骤。

全过程仅在一个离心管内完成，避免微量样品的损失，且不容易交叉污染，比常用的抽提试剂盒简单，方便。

兼容性广，适用于常见的分子生物学样品，包括细菌、昆虫、各种动物组织、口腔细胞、毛发、组织中的细菌和病毒等。

核酸提取仪是应用配套的核酸提取试剂来自动完成样本核酸提取工作的仪器。广泛应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。

核酸提取仪分类

根据仪器型号大小不同划分

1) 自动液体工作站

自动液体工作站是功能非常强大的设备，液体分液、吸液等自动完成，甚至能通过整合扩增、检测等功能，实现标本提取、扩增、检测全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用，不太适合常规实验室提取核酸，一般都应用在单一类标本并且一次提取标本量非常大(至少96个，一般几百个)的实验需求上。自动工作站的平台建立及平台的运作，需要比较大的资金。

2) 小型自动核酸提取仪小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊性来达到自动提取核酸的目的，可以在任何实验室得到应用。

根据提取原理不同划分

1) 采用离心柱法的仪器

离心柱法核酸提取系仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法，通量一般在1-12个样本，操作时间和手工提取差不多，并不能提高实际工作效率，且价格昂贵，不同型号仪器的耗材也不能通用，仅适合经费充足的大型实验室使用。

2) 采用磁珠法的仪器

以磁珠为载体，利用磁珠在高盐低PH值下吸附核酸，在低盐高PH值下与核酸分离的原理，再通过移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个提取纯化过程。由于其原理的独特性，所以可设计成很多种通量，既可以单管提取，也可以提取8-96个样本，且其操作简单快捷，提取96个样本仅需30-45min，大大提高了实验效率，且成本低廉，因而可以在不同实验室使用，是目前市场上的主流仪器。

磁珠法自动核酸提取仪又分为磁棒法和抽吸法

先说抽吸法：顾名思义，抽吸法就是通过自动移液装置来进行，通过自动移液装置来加入裂解液、磁珠吸附；抽走裂解液，加入漂洗液，磁珠吸附，抽走漂洗液，加入洗脱缓冲液。从步骤上好像没什么问题，但是抽吸法最大的问题在于，为了在去除废液的时候不抽走磁珠，移液器不能靠磁珠太近，以防磁珠连同废液被抽掉，这样每一次抽废液的时候总有一小部分不能彻底的抽走，特别是磁铁在底部的装置，因为磁珠被磁铁吸附在底部，所以移液器不能靠底部太近，这样漂洗液就不能完全去除，残留的漂洗液中的盐和乙醇会影响后面的洗脱效率和PCR成功率；磁铁在侧面的装置残留的液体会少些，但是洗脱的效率也不好，依靠DNA自行溶解到洗脱缓冲液中，除非等上半小时以上，所以有些96自动核酸提取工作站，提取一轮的时间需要150分钟，32磁棒法的同样的时间可以提5轮了。

再说磁棒法核酸提取仪：通量通常有8、16、32、96通道，相对于抽吸法，磁棒法的优点是每一步的液体不残留，因为磁棒只带走磁珠，转移到下一个步骤相应的反应孔中，另外选择磁棒法的提取仪最好要功能更齐全的，比如可以加热，每个加热槽最好独立温控，这样可以设置加热、裂解、洗脱的不同温度，另外很重要的一点是，带动磁棒的电机要能带动磁棒进行液体的快速混匀和搅拌，这样才有利于自动化和有助于裂解和漂洗彻底。磁棒法的通量选择最好是32通道，96通道的看似通量更高，但是有个很现实的问题，96个磁力棒在从一个板转移至另外一个板的时候，磁力棒上面的液体中途滴下来怎么办，它会滴到别的孔中造成污染，而32通道的磁力棒运行轨迹不经过其他样本的上空，这样不会交叉污染。

磁珠法核酸提取仪的基本原理

抽吸法

抽吸法，也叫移液法，是通过固定磁珠、转移液体来实现核酸的提取，一般通过操作仪控制机械臂来实现转移。提取过程如下:

1) 裂解：在样品中加入裂解液，通过机械运动及加热实现反应液的混匀及充分反应，细胞裂解，释放核酸。

2) 吸附：在样品裂解液中加入磁珠，充分混匀，利用磁珠在高盐低PH值下对核酸具有很强亲和力的特点，吸附核酸，在外加磁场作用下，磁珠与溶液分离，利用吸头将液体移出弃至废液槽，吸头弃掉。

3) 洗涤：撤去外加磁场，换用新吸头加入洗涤缓冲液，充分混匀，去除杂质，在外加磁场作用下，将液体移出。

4) 洗脱：撤去外加磁场，换用新吸头加入洗脱缓冲液，充分混匀，结合的核酸即与磁珠分离，从而得到纯化的核酸。

磁棒法

磁棒法是通过固定液体，转移磁珠来实现核酸的分离，原理和过程与抽吸法的一样，不同的是磁珠和液体分离的方式。磁棒法是通过磁棒对磁珠的吸附将磁珠从废液中分离开，放入下一步的液体中，实现核酸的提取。

磁珠法核酸提取仪的特点

1、能够实现自动化、高通量操作。

2、操作简单、快速。

3、安全环保。

4、高纯度，高得率。

5、无污染，且结果稳定。

6、成本低廉，便于广泛应用。

7、 可以同时处理不同类型的样本

注意事项

1、仪器的安装环境：正常的大气压(海拔高度应该低于3000m)、温度20-35℃、典型使用温度25℃、相对湿度10%-80%、畅通流入的空气为35℃或以下。

2、避免将仪器放置在靠近热源的地方，如电暖炉；同时为防止电子元件的短路，应避免水或者其他液体溅入其中。

3、进风口和排风口均位于仪器背面，同时避免灰尘或纤维在进风口聚集，保持风道的畅通。

4、核酸提取仪离其他竖直面至少10cm，

5、仪器接地：为了避免触电事故，仪器的输入电源线必须接地。

6、远离带电电路：操作人员不得擅自拆解仪器，更换元件或进行机内调节必须有持证的专业维修人员完成，不要在接通电源的情况下更换元件。

自8月份以来，新冠疫情再次变成“常态”，世界各地出现不同程度和规模的疫情，每天都有成千上万份等待进行检测的新冠肺炎核酸样本。这些样本在实验室是如何被检测出来的？作为人类与新冠病毒战斗的“第一战场”的P3实验室长什么样，核酸检测全过程是怎样的呢？

根据危险度等级，包括传染病原的传染性和危害性，国际上将生物实验室将实验室分为P1、P2、P3和P4四个等级。P1-4实验室可承担的工作也根据这一安全等级进行划分，其严格等级从低到高。P3实验室又称防护实验室，适用于处理对人体、动植物或环境具有高度危害性，通过直接接触或气溶胶使人传染上严重甚至是致命的疾病，或对动植物和环境具有高度危害的致病因子，通常有预防和治疗措施。

核酸检测在实验室内是如何进行的？

大致可分为：检测前的准备工作——核对样本信息——样本灭活——开盖加样和核酸提取——PCR反应体系配制——核酸扩增检测——检测完成——高压灭菌。

检测前

打开样本前，检测人员需穿戴好个人装备防护装备，如防护服、口罩、护目镜、面屏、双层医用乳胶手套、防水靴套，每个步骤不能出错。

检测中

1、在实验室核心区域内使用75%酒精对送样箱进行外表面消毒，消毒完毕后核对被检测样本的姓名、年龄、性别等信息进行核对。

2、将样本放在水浴箱中进行半个小时的56℃的高温灭活，使病毒蛋白失去生理活性，在不影响病毒蛋白的基因序列的前提下，使病毒失去感染、致病和繁殖能力，保证检测的安全性。

3、实验员拿到灭活后的样本时，第一步是进行振荡，尽量让拭子上的病毒洗脱在培养基溶液中，第二步是进行5分钟的沉淀。第三部进行开盖加样，这一步必须实行人工操作，并且需要两人高度配合完成。一人拧开样本罐的盖子，另一人拿微量移液器在样本罐中吸取微量溶液，放到另一个提取管里，再拧上管盖。

核酸提取可以使用仪器辅助，但由于比对需要，往往要加以人工操作，需要反复进行离心、加试剂、洗涤等10多个步骤。其中，需要打开管盖的操作就达7次以上，完成一例人工核酸提取需要50分钟左右。

4、走出核心试验区，开始进行PCR反应体系配制，将提取的病毒核酸加入到核酸扩增检测试剂中。

5、将配制好的PCR反应物放置在荧光定量PCR仪上。在电脑上设置PCR反应条件，运行仪器，开始核酸扩增检测。

检测后

测人员需要实时关注检测情况，约1.5小时后，核酸扩增完成，进行检测结果判读。至此，整个流程完成，大概4小时。

最后的，也是非常重要的一步就是对污染物的高压灭菌处理。实验过程产生的污染物通过高压灭菌后，按普通医疗垃圾处理。

可以说，核酸检测的过程也是与时间赛跑的过程。尤其是需要大规模进行核酸检测的场景中，运输到指定位置的实验室进行检测显然要付出较高的时间成本。可移动实验室的运用为提高核酸检测效率提供了行之有效的方法。

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