随着2019新型冠状病毒疫情的反弹，核酸检测需求大幅增加，但是随之而来，核酸检测结果的准确性引起广泛关注，“漏检”情况使一些临床医生和民众对检测试剂盒的质量提出了疑问。那么，有可能影响目前核酸检测准确性的因素有哪些呢？爱森作为专业的核酸提取试剂供应商从标本采集、标本保存及运送、核酸提取、扩增检测等环节给我们分享了如何提高新型冠状病毒核酸检测的准确性。

1、标本采集

正确取样是实验成功的关键。据了解，由于可操作性的限制，目前比较常见的采样方法是使用鼻咽拭子、痰液或肺泡灌洗液采集，最常用的方法为采集鼻咽拭子标本。但是鼻咽拭子的取样技术会影响检测的准确性，最好由经过培训的护士给患者取样，需要从患者鼻咽部采集到足够有效的细胞，经验不足的护士可能获取不到合格的标本。

另外，进行标本采集所使用的鼻咽拭子和保存液，对采集到的标本质量和保存效果也会有影响，推荐使用可以吸附和释放更多样本的无菌植绒拭子以及无游离DNA酶和RNA酶的细胞保存液，可以更好地保存病毒核酸，避免新型冠状病毒RNA降解。

2、标本保存及运送

新型冠状病毒为RNA病毒，在标本保存和运送时需特别注意保存温度及相应时间长短，避免核酸降解，造成假阴性。标本采集后应尽快送检，采集后在2h～4h内送到实验室。血液标本室温运送，其他标本在2℃～8℃下转运；若运送时间超过24h，标本宜在-70℃或更低的温度下保存，短距离转运应在2℃～8℃下进行，长距离转运应采用干冰运输。标本运送保存期间应避免反复冻融。

3、核酸提取

核酸检测对实验室、设备、人员和试剂有较高的要求。需要专门的PCR实验室分区，才能保证检测结果的准确性。核酸提取是进行核酸检测中至关重要的一步。

目前批准的试剂盒中只包含新型冠状病毒核酸检测所需的扩增试剂，未包含核酸提取试剂。不同核酸提取试剂或核酸提取系统的提取效率可能存在差异，推荐使用已经验证过的提取方法和提取试剂进行核酸提取，以保证检测结果的准确性。

为保证检测人员安全和核酸提取的纯度和效率，可采用基于磁珠吸附的自动化核酸提取方法。多家权威实验室和相关专家建议采用体积小巧的半自动核酸提取仪，放入生物安全柜中，在安全柜中完成样本加样和核酸提取的全部步骤，简便高效，保护操作者安全。

4、扩增检测

新型冠状病毒的核酸检测主要针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1ab（ORF1ab）和核壳蛋白（N）、包膜蛋白（E）进行检测。在实验室要确认一个病例为阳性，满足以下条件：同一份标本中3个靶标（ORF1ab、N、E）特异性实时荧光RT-PCR检测结果两个以上（含两个）阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。

阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染，需要排除可能产生假阴性的因素，包括：标本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；标本收集的过早或过晚；没有正确的保存、运输和处理样本；技术本身存在的原因，如PCR抑制等。

因疫情蔓延严重，新型冠状病毒核酸检测试剂盒研发、应急审批的推进紧迫，前期可能缺乏足够临床样本验证数据，存在灵敏度和特异性优化不够充分的风险。各厂家试剂性能和阳性检出率存在差别，多数试剂盒只检测ORF1ab和N基因这2个靶标，部分试剂单靶标阳性结果占阳性结果的20%以上。对单靶标阳性结果及可疑结果建议采用不同试剂盒进行复核，或送CDC确证，但会增大工作量，延迟确诊时间。从公开信息来看，目前批准的试剂都不含UNG酶和dUTP防污染系统，存在污染和假阳性风险。

随着新冠病毒核酸检测热度攀升，核酸检测已经深入人心，成为病原体检测的“金标准”。新冠疫情以来，短时间内需要出具大量样本检测结果，核酸检测对快速、高效检测的需求越来越迫切。而核酸提取作为核酸检测的重要步骤，同样面临着高通量、高效率的要求。

核酸检测有赖于核酸提取技术的发展，目前临床上主要应用的核酸提取方法有磁珠法、离心柱法、煮沸法、快速核酸释放法，而磁珠法核酸提取方法目前已经得到广泛应用的已实现自动化的核酸提取方法，自动化磁珠法提取主要有磁棒式提取、移液式提取。

一、磁珠法核酸提取原理

磁珠法核酸提取技术是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合，在外部磁场的作用下发生聚集或分散，彻底摆脱传统核酸提取过程中离心、抽取上清液等手工操作流程，从而实现核酸提取纯化的方法。目前所使用的磁珠大多数都是“核-壳”结构，都是以具有超顺磁性的纳米微粒作为“核”，再在核的表面包裹上一层高分子有机化合物和一层功能基层作为“壳”，在溶液中有较好的悬浮性。在磁场中被磁化，在磁力的作用下聚集，极易与不具有磁性的物质分离开来，操作过程中无需离心等操作。

二、磁珠法核酸提取的不同点

磁珠法核酸提取由裂解、结合、洗涤、洗脱等步骤组成，不同厂家生产的磁珠法核酸提取试剂有所不同，主要体现在：（1）磁珠大小不同；（2）磁珠修饰方式不同；（3）洗涤方式不同；（4）样本量不同。

磁珠粒径小，比表面积大，核酸捕获能力强，可带磁珠上机检测，提高检测灵敏度。粒径大小不一样，对于不同大小的核酸片段有不同的喜好性，一般来说粒径较大的磁珠，磁响应性比较大，捕获小片段核酸的能力大一点。粒径较小的磁珠，磁响应性比较小，捕获大片段核酸能力大一点。不同粒径磁珠，比表面积不同，捕获核酸能力不同。与此同时，粒径较大的磁珠，比表面积较小，捕获核酸能力稍差；粒径较小的磁珠，比表面积较大，捕获核酸能力稍强。而洗脱步骤直接影响核酸得率，当然磁珠粒径小、透光性强，不影响荧光定量PCR仪检测信号采集的情况下也可采用带磁珠上机检测（洗脱时加入PCR反应液混匀磁珠后进行检测）的方式进行核酸检测，核酸几乎没有丢失，全部模板核酸上机检测，可以提高核酸检测灵敏度。

官能基团-靶向核酸探针修饰，进一步提高靶向核酸提取效率，提高靶向核酸检测灵敏度。在磁珠壳层结构中的功能基层所含的官能团不一样，磁珠与核酸特异性结合能力不同。目前常用的修饰官能团有氨基（-NH2）,羧基（-COOH），羟基（-OH）。

由于功能基团不一样，所以使用的结合缓冲液也不同，羟基带有负电性，显碱性，在碱性溶液里能够稳定存在，羧基显酸性，在酸性溶液里能够稳定存在。官能基团-靶向核酸探针的修饰方式，可以提高靶向核酸序列的特异性结合能力，进一步提高核酸提取效率。

洗涤次数越少，核酸损失越少，核酸得率越高。一般来说洗涤次数越多，核酸丢失的可能性越大，核酸得率可能越低。步骤越多会影响自动化核酸提取的稳定性，实现自动化的难度越大。圣湘生物高精度磁珠法 HBV DNA定量检测、HCV RNA定量检测、HIV-1型RNA定量检测产品，采用一次洗涤的方式，降低核酸损失的概率，提高核酸检测灵敏度，以及自动化核酸提取检测的稳定性，圣湘生物近期推出的“快速磁珠法”核酸提取试剂，采用样本核酸裂解、无需洗涤、直接洗脱的方式对血清、血浆、全血、咽拭子等样本进行核酸提取，大大缩短核酸提取时间，降低核酸损失的可能性，提高核酸检测灵敏度。

加大样本量，提高核酸检测灵敏度。加大上样样本量，也是目前一些厂家通常的做法。比如罗氏诊断、雅培诊断的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，通过加大样本量，提高核酸浓度的方法，达到高敏检测的目的，其灵敏度可达到10 IU/mL。

总之，磁珠法核酸提取技术是目前市场上临床应用最广泛的自动化核酸提取技术，在新冠病毒疫情防控中起到中流砥柱的作用。不同厂家生产的磁珠法核酸提取试剂，核酸裂解方式、磁珠结合能力、洗涤方式、洗脱方式均有所不同，只有核酸裂解效率足够高、磁珠特异性结合能力足够强、洗涤次数足够少、洗脱效率足够高（或原始样本核酸洗脱上机检测）的磁珠法核酸提取试剂，才能保证有更高的核酸提取效率，才能做到高敏或超敏核酸检测，才能保证更好的自动化核酸提取稳定性。

生物技术的发展日新月异,随着PCR技术在各个领域的应用,包括医学方面疾病检测、农业方面转基因检测以及其他很多方面的应用等,高通量的样本核酸提取已经变得极为迫切,很多公司推出了全自动核酸提取的仪器,各种原理的都有,如何选择一款合适的核酸自动提取仪,就得细细分析。

从提取原理上来看,有离心柱法、磁珠法。离心柱法全自动核酸提取系统采用离心机和自动移液装置想结合的方法,通量一般在1-12个样本 ,时间上和手工提取差不多,并不能提高效率,价格也不便宜,耗材还不通用,适合经费充足的实验室使用。

磁珠法自动核酸提取系统又分为磁棒法和抽吸法,先说抽吸法,顾名思义,抽吸法就是通过自动移液装置来进行,通过自动移液装置来加入裂解液、磁珠吸附,抽走裂解液,加入漂洗液,磁珠吸附,抽走漂洗液,加入洗脱缓冲液。

从步骤上好像没什么问题,但是抽吸法最大的问题在于,为了在去除废液的时候不抽走磁珠,移液器不能靠磁珠太近,以防磁珠连同废液被抽掉,这样每一次抽废液的时候总有一小部分不能彻底的抽走,特别是磁铁在底部的装置,因为磁珠被磁铁吸附在底部 ,所以移液器不能靠底部太近,这样漂洗液就不能完全去除,残留的漂洗液中的盐和乙醇会影响后面的洗脱效率和PCR成功率;磁铁在侧面的装置残留的液体会少些,但是洗脱的效率也不好,依靠DNA自行溶解到洗脱缓冲液中,除非等上半小时以上,所以有些96自动核酸提取工作站,提取-轮的时间需要150分钟, 32磁棒法的同样的时间可以提5轮了。

再说磁棒法核酸提取系统,通量通常有8、16、 32、 96通道,相对于抽吸法,磁棒法的优点是每一步的液体不残留,因为磁棒只带走磁珠,转移到下一个步骤相应的反应孔中,另外选择磁棒法的提取仪器最好要功能更齐全的,比如可以加热,每个加热槽最好独立温控,这样可以设置加热、裂解、洗脱的不同温度,另外很重要的一点是,带动磁棒的电机要能带动磁棒进行液体的快速混匀和搅拌,这样才有利于自动化和有助于裂解和漂洗彻底。磁棒法的通量选择最好是32通道, 96通道的看似通量更高,但是有个很现实的问题, 96个磁力棒在从一个板转移至另外一个板的时候,磁力棒上面的液体中途滴下来怎么办,它会滴到别的孔中造成污染,而32通道的磁力棒运行轨迹不经过其他样本的上空,这样不会交叉污染。

以上就是关于核酸提取系统选择的相关介绍，但很多人还是很容易陷入选择误区，下面举例说明最常见的二种选择误区:

误区一、核酸提取系统和工作站的区别及选择误区

很多工作站的厂家在推销工作站的时候经常和客户说，工作站提核酸是全自动的，而核酸提取系统是半自动的，客户也主观认为工作站可以移液，提取，什么都能干，好像只要把样本放进去，什么都不用管就可以得到想要的核酸了，等到工作站到位的时候发现，实际情况并不是那样，不仅没想象中的那么好，甚至连基本的提取核酸都困难，那么原因是什么呢?

第一个问题，开盖问题，采血管、唾液保存管、二维码冻存管等的盖子结构都不一样，大小也不一样，厂家也不一样，工作站如何自动化开盖?这个问题就解决不了。

第二个问题，条码录入问题，条形码和二维码，还有-些手动贴的标签和手写的标签，所以扫码还是手动为主，很难自动化。

第三个问题，加液自动化，工作站可以实现自动加试剂，好像是个优势，但是加一个96深孔板需要花15~30分钟左右的时间，而提取一般需要六种试剂，也就是六个板子，大约1.5小时时间，提取试剂很多含有高浓度的乙醇，这么长时间，乙醇浓度会发生改变，影响提取效率和灵敏度，再说了，很多提取仪的厂家(比如百泰克，百源基因等)都有配套预装试剂盒,不需要加液，自动加试剂这个功能就是个鸡肋。

误区二、进口和国产的区别，这个是最大的选择误区

很多人在选择核酸提取系统的时候是依据习惯性思维，认为进口的比国产的好;但是核酸提取仪是属于应用型设备，不是基础实验设备，不是那种插上电就可以用的设备，核酸提取需要仪器、配套试剂盒和应用程序的整体配合，需要厂家根据样本类型选择最适合的提取试剂盒和程序，经常需要优化试剂和程序，没有厂家的技术支持，你是无法用的好的。这就很好的解释了为什么很多进口工作站、提取仪集体趴窝,没有人用的原因;进口仪器应用技术支持跟不上，进口仪器技术上门都需要很贵的上门费，而且并不能保证能帮客户把实验方案优化出来(当然上门费都要收)。

综合上，多数核酸提取系统在仪器操作系统便捷性、仪器提取灵敏度和得率、仪器配套试剂盒、仪器的升级改造定制能力等方面都赶不上国内厂家,而且售后服务收费贵更是硬伤，实在没有必要再去论证进口的优越性了。通过以上的论述，我们应该清楚，在选择一款核酸提取系统的时候，最好充分的调研或者试用，以免陷入买了不能用的被动局面。

免疫磁珠技术是 20世纪 80年代出现的技术方法。以免疫学为基础，渗透到病理、生理、药理、微生物、生化及分子遗传学等各个领域，其在免疫检测、细胞分离、生物大分子纯化和分子生物学等方面有着越来越广泛的使用。

免疫磁珠的结构：

磁珠是由核心金属颗粒（Fe2O3, Fe3O4）, 核心外层包裹的高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯）和最外层的功能配基（如-NH2，-COOH、-OH、-CHO）组成。

免疫磁珠在生物医学领域的应用：

1.细胞分选

免疫磁珠细胞分选可在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞。应用纳米级的磁珠进行细胞分选时，磁珠的大小和它的组成成份使其可被生物降解，且不会激活细胞或影响细胞的功能和活力，细胞的生理功能也不变，因此磁性标记细胞可立即用于分析和随后的实验。

细胞分选可分为：

a)阳性分选（正选）：磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞，适用于流式分析和基于细胞的分析。

b)阴性分选（负选）：磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞。

正选（左）及负选（右）分别如下：

磁分选细胞的重要指标：

纯度和得率，这取决于磁珠所连接单抗的特异性和磁珠大小（磁性），然而太小的磁珠得率不高，太大的磁珠又会影响细胞活性，也无法直接上流式。

2.蛋白质/抗体分离与纯化

应用抗体（蛋白）包被的免疫磁珠纯化技术无需复杂的层析设备，对样品的澄清度无限制，只需要简单的磁性吸附步骤即可很方便地从单抗表达产物中分离单抗，有效解决了传统层析技术的不足之处。

3.核酸分离纯化

核酸结合到磁珠上主要依靠静电作用、疏水作用和氢键作用。细胞或组织在裂解液作用下，其中的DNA/RNA被释放出来。此时经过表面修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠即与核酸进行“特异性结合”，形成“核酸-磁珠复合物”。然后在外加磁场的作用下，复合物即分离出来。可广泛应用于分子生物学中的基因组研究、分子进化研究、医学中遗传病的研究、突变基因的检测、肿瘤的筛查、HPV等的检测、HLA分型、移植配型等、法医学生物样本血斑、精斑、头发、烟蒂等现场证物的检测、和司法上的亲子鉴定、血缘关系的鉴定等提供证据、考古学、大中小学的生物试验等许多领域。

磁珠法提取核酸：

 

传统核酸提取法	磁珠提取核酸法
技术难度不大	高质量、高产量、高通量
手工提取	实现流程自动化
操作繁琐，费时费力	免去了复杂的人工提取程序
不适合大量样品的核酸提取	减少酚类、氯仿等有机试剂对操作人员的伤害
不适合临床分子诊断	极大满足如今市场对于核酸提取效率的要求

4.免疫检测

免疫磁珠由于粒径小，比表面积大，可捕获较多的待测物，并直接在其表面进行酶显色、荧光或同位素显示，从而建立了一系列检测速度快、特异性高、灵敏度高和重复性好的免疫检测方法。

5.其它应用

在高梯度磁场下，用免疫磁珠法分离腹腔血或静脉中B、T淋巴细胞，分离的淋巴细胞随之在临床器官移植供受者的快速选配中有广泛应用。进行HLA-I II类抗原分型。

磁珠技术作为一种交叉学科汇聚研发而成的产品，其在生物学及医学实验检测中作用巨大。借助于二代测序的飞速发展，二代测序多涉及的耗材也迎来了它的春天。

无论是用于提取核酸的磁珠，还是作用于细胞分选、免疫检测所用的免疫磁珠，其在分子生物学领域仍然属于行业的细分领域，其中的技术仍然在不断进步发展中，随着越来越多公司的加入，其研发的产品价格也将越来越便宜。

核酸提取系统是使用通用磁珠法提取核酸的高科技产品,具有自动化程度高,提取速度快,结果稳定,操作简便的优点。几乎在每个实验室,与生物分子相关的分离纯化工作都是十分重要的。

但要对多个样品进行纯化还是相当困难的,不仅需要选择合适的纯化技术，而且工作量也特别大,很难满足当前飞速发展对高通量样品进行提取纯化的需求。

而磁珠法核酸提取系统,非常适合于基因组学的研究。无论提取样本的来源是微生物、动物、植物或是病毒,结合特别针对磁珠提取纯化系统优化的全血基因组DNA提取试剂盒、白细胞层全血基因组提取试剂盒、动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒,可以快速的纯化出足够数量和纯度的DNA或RNA.

 

我们在使用核酸纯化仪进行分离实验时应注意些什么呢? .

1、保证核酸一级结构的完整性

2、去除其它生物大分子的污染(蛋白、糖类、脂类分子)。

3、去除其它核酸分子的污染(提取DNA,去除RNA污染)。

4、去除对酶有抑制作用的有机溶剂和高浓度金属离子。

5、简化操作步骤缩短提取过程。

6、防止物理、化学因素(剪切力、高温、强酸强碱)对核酸的降解。

7、防止生物因素(核酸酶)对核酸的降解,

核酸纯化仪测量结果稳定,避免人工操作引起的差异及错误,结果温度,重复性好。该纯化仪可根据试剂优化提纯方案,配合精确的温育时间,实现了更高的提取效率,提取的DNA/RNA纯度高,可以直接用于PCR和RT-PCR.

本产品拥有强大的程序编辑功能;灵活、高效地定义您的应用,可满足不同试剂要求。可根据需求自定义裂解、洗脱温度。内建工程用电脑，无需再连接个人电脑;单机操作节省更多的空间与能源,并提供高稳定度的自动化控制系统。