Обычно используемые лабораторные тесты на инфекционные заболевания включают микробный посев, выделение вируса, тестирование нуклеиновых кислот и тестирование на антитела. Тестирование на нуклеиновые кислоты также является методом обнаружения вирусов, которые могут выявить инфекции раньше. В клинической практике проводились тесты на нуклеиновые кислоты на гепатит B, гепатит C и СПИД, которые позволяют выявить присутствие вирусов в крови до образования антител. При некоторых респираторных заболеваниях можно использовать анализ мазков из горла или выделений из дыхательных путей на нуклеиновые кислоты, чтобы определить, инфицированы ли они и являются ли они заразными. О сезонном гриппе, птичьем гриппе, коронавирусных инфекциях и т. Д. Можно легко судить о наличии вирусных компонентов в верхних дыхательных путях с помощью мазка из горла, чтобы определить, является ли тестируемый инфицированным человеком. Итак, насколько точно обнаружение нуклеиновых кислот?

В настоящее время нет точных статистических данных по большой выборке, подтверждающих точность обнаружения нуклеиновых кислот, но есть много факторов, которые влияют на точность, такие как качество реагентов обнаружения, время заражения тестируемого человека (слишком раннее или слишком поздно снизит точность), образцы Содействие экзаменуемого при взятии материала (плохое взаимодействие может привести к тому, что образец не будет взят на место), а также профессиональные навыки экзаменатора и т. д.

Если все аспекты обнаружения нуклеиновых кислот точны, точность обнаружения нуклеиновых кислот может достигать более 95% в идеальных условиях. Но по разным причинам будут появляться ложноотрицательные результаты. Так называемый ложноотрицательный результат означает, что испытуемый действительно инфицирован, но результат теста на нуклеиновую кислоту отрицательный, что является ложноотрицательным. По мере совершенствования технологий точность различных медицинских учреждений быстро повышается, а количество ложных отрицательных результатов постоянно снижается.

Кроме того, людям, имевшим тесный контакт с подтвержденными или подозреваемыми случаями, обычно требуются два теста на нуклеиновую кислоту, чтобы их исключить. Для людей, которые побывали в зонах повышенного риска заражения новым коронавирусом, если у них есть лихорадка и респираторные симптомы, отрицательный тест на нуклеиновую кислоту может иметь ложноотрицательный результат, поэтому для исключения необходимы два теста на нуклеиновую кислоту. Кроме того, если врач считает, что тест на нуклеиновую кислоту отрицательный и все еще не может быть исключен, тест на нуклеиновую кислоту необходимо проверить снова. Иногда врач также порекомендует КТ грудной клетки, анализы крови и тесты на антитела сыворотки к новому коронавирусу, чтобы определить, инфицирован ли он.

С быстрым развитием генетической диагностики, обнаружения генетически модифицированных пищевых продуктов, персонализированной медицины и т. Д. Текущая технология экстракции нуклеиновых кислот больше не может удовлетворять потребности современной биотехнологии, и существует острая потребность в высокопроизводительной и автоматизированной нуклеиновой кислоте. метод экстракции. В этом контексте и появился метод магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот.

Использование магнитных шариков для извлечения ДНК — одна из областей, в которых их биологическая ценность максимальна. Основные типы используемых микросфер включают силанольные магнитные шарики и олигомагнитные шарики. Магнитные шарики с поверхностными группами могут специфически и обратимо связываться с нуклеиновыми кислотами, высвобождаемыми в исследуемом образце. В то же время способность магнитных шариков к магнитному отклику используется для осуществления направленного движения и обогащения под действием внешнего магнитного поля, чтобы реализовать разделение и очистку нуклеиновой кислоты. Основные преимущества метода экстракции нуклеиновой кислоты с помощью магнитных шариков включают простую и автоматизированную операцию, крупномасштабную операцию и короткое время.

1. Что такое магнитная бусина

Магнитные шарики — это особые наномикронные материалы. Их размер обычно составляет от нескольких десятых долей микрона до нескольких микрон, что составляет от одной десятой до одной десятой диаметра человеческого волоса, что не может быть замечено невооруженным глазом. Одиночная магнитная бусина. Они суперпарамагнитны, могут быстро перемещаться в сторону в магнитном поле, собираться вместе и могут быстро возвращаться в дисперсное состояние после снятия магнитного поля.

Поверхность магнитных шариков, используемых для экстракции нуклеиновых кислот, обладает особыми свойствами. В определенных условиях вирусная нуклеиновая кислота может адсорбироваться на поверхности, а в других условиях вирусная нуклеиновая кислота может высвобождаться с поверхности для последующих стадий обнаружения.

2. принцип метода извлечения нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков

Связывание нуклеиновой кислоты с магнитными шариками в основном зависит от электростатических, гидрофобных и водородных связей. ДНК / РНК в клетке или ткани высвобождается под действием раствора для лизиса. В это время поверхностно-модифицированные суперпарамагнитные наномагнитные гранулы из диоксида кремния «специфически связываются» с нуклеиновой кислотой с образованием «комплекса нуклеиновая кислота-магнитная гранула». Затем под действием внешнего магнитного поля комплекс отделяется. После промывания элюата для удаления неспецифически адсорбированных накопителей, обессоливания и очистки получают экстрагируемое вещество нуклеиновой кислоты.

В соответствии с тем же принципом, что и спин-колонка с силикагельной мембраной, поверхность суперпарамагнитных наночастиц модифицируется и модифицируется с помощью нанотехнологий для получения суперпарамагнитных наномагнитных шариков из диоксида кремния. Магнитные шарики могут специфически распознавать и эффективно связываться с молекулами нуклеиновой кислоты на микроскопической границе раздела. Используя суперпарамагнетизм наносфер кремнезема, под действием хаотропных солей (гидрохлорид гуанидина, изотиоцианат гуанидина и т. Д.) И внешнего магнитного поля ДНК и ДНК можно отделить от таких образцов, как кровь, ткани животных, продукты питания и патогенные микроорганизмы. РНК может использоваться в клинической диагностике заболеваний, безопасности переливания крови, судебно-медицинской идентификации, микробиологическом тестировании окружающей среды, тестировании безопасности пищевых продуктов, исследованиях молекулярной биологии и других областях.

Фактически, поскольку испытательным учреждениям необходимо обрабатывать большое количество образцов каждый день, большинство этапов экстракции нуклеиновых кислот выполняется с помощью автоматического прибора для экстракции нуклеиновых кислот с набором для экстракции нуклеиновых кислот методом магнитных шариков.

С постоянным развитием биомедицины обновляется и технология экстракции нуклеиновых кислот. Экстракция нуклеиновых кислот с помощью магнитных гранул, как новый тип технологии экстракции нуклеиновых кислот, позволяет извлекать нуклеиновые кислоты с высокой производительностью и автоматизацией, удовлетворяя потребности современной биотехнологии. Кроме того, этапы метода магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот относительно просты, легки в эксплуатации и хорошо воспринимаются. Далее я поделюсь с вами этапами и принципами метода магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот.

Метод магнитных шариков для стадий экстракции нуклеиновых кислот

1. Добавьте 1 мл деионизированной воды в каждый флакон с 40 мг сухого порошка протеиназы К до конечной концентрации 40 мг / мл и добавьте 500 мкл деионизированной воды в каждый флакон с 20 мг сухого порошка протеиназы К до конечной концентрации 40 мг / мл. и перемешайте в перевернутом виде. Его можно полностью растворить один раз, и его можно хранить при 4 ℃ для кратковременного использования. Пожалуйста, храните его при -20 ℃ для длительного хранения. Повторное замораживание и оттаивание не должно превышать пяти раз.

2. Образец ткани измельчают в мелкий порошок с 10-30 мг жидкого азота, переносят в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, ресуспендируют в 200 мкл 1-кратного буфера PBS, а затем переходят к следующему этапу. Жидкая проба переходит непосредственно к следующему этапу.

3. Возьмите 500 мкл вирусного лизата VL и добавьте его в 1,5 мл центрифужную пробирку без ферментов, затем добавьте 25 мкл протеиназы K и 25 мкл вирусных магнитных шариков (перед добавлением хорошо встряхните), а затем добавьте 200 мкл сыворотки / плазмы / ткани. гомогенат образец, перемешайте на вортексе и хорошо перемешайте на водяной бане с температурой 55% в течение 20 минут, переворачивайте и перемешивайте в течение 10 секунд каждые 5 минут.

4. Выньте центрифужную пробирку без ферментов из водяной бани, поместите ее на магнитную подставку и намагничивайте в течение 90 секунд, чтобы полностью адсорбировать магнитные шарики. Используйте пипетку, чтобы аккуратно аспирировать и выбросить супернатант (будьте осторожны, чтобы не притягивать магнитные шарики на дне пробирки).

5. Снимите центрифужную пробирку с магнитной подставки, добавьте 700 мкл промывочного раствора BufferA, перемешайте пипеткой или встряхиванием в течение 30 секунд, чтобы ресуспендировать магнитные шарики, затем поместите центрифужную пробирку на магнитную подставку и намагнитите в течение 90S, чтобы сделать шарики. Полностью адсорбированный, осторожно аспирируйте супернатант и слейте его пипеткой.

6. Возьмите 700 мкл промывочного раствора BufferB, добавьте его в центрифужную пробирку, постарайтесь не сдуть магнитные шарики, а затем аспирируйте и слейте супернатант.

7. Добавьте 80 мкл буфера для элюции, снимите центрифужную пробирку и купите в водяной бане при 56 ° C в течение 5 минут. В течение этого периода встряхивайте 3-4 раза, чтобы элюировать нуклеиновую кислоту с магнитных шариков.

8. Поместите центрифужную пробирку на магнитную подставку и притяните ее магнитом в течение 60 секунд, перенесите жидкость в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, не содержащую ферментов, и перейдите непосредственно к последующему эксперименту или храните при -20 ° C.

Принцип метода магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот

Его принцип в основном основан на электростатическом взаимодействии, гидрофобном взаимодействии и взаимодействии водородных связей. ДНК / РНК в клетке или ткани высвобождается под действием лизата. В это время поверхностно-модифицированные суперпарамагнитные наномагнитные гранулы из диоксида кремния «специфически связываются» с нуклеиновой кислотой с образованием «комплекса нуклеиновая кислота-магнитная гранула». Затем под действием внешнего магнитного поля комплекс отделяется. Затем элюат используется для вымывания неспецифически адсорбированных примесей, обессоливания и очистки для получения экстрагируемого вещества нуклеиновой кислоты.

Использование биологических магнитных шариков для экстракции нуклеиновой кислоты является новым методом экстракции нуклеиновой кислоты. По сравнению с традиционным методом экстракции хлороформом, изоамиловым спиртом и методом набора спин-колонок, этот метод все еще понятен многим людям. Есть также некоторые недоразумения в процессе очистки нуклеиновых кислот жемчужным методом.

Недоразумение 1. Чем больше магнитных шариков, тем лучше эффект извлечения.

Некоторые думают, что при плохом эффекте экстракции увеличьте количество магнитных шариков. Они думают, что добавление немного большего количества магнитных шариков может привлечь больше нуклеиновых кислот. На самом деле это не рекомендуется.
Основная особенность магнитных шариков заключается в том, что они могут быть диспергированы в жидкости или отделены от жидкой фазы в твердом состоянии под действием внешнего магнитного поля. Для любой системы реагентов отношение магнитных шариков к жидкости должно иметь определенное значение, превышающее определенное соотношение. Избыточные магнитные шарики потеряют свои дисперсионные характеристики, поскольку они не могут быть равномерно диспергированы в жидкости, и эффективность контакта между магнитными шариками нуклеиновой кислоты. шарики и жидкость не могут быть полностью увеличены в процессе стирки.
Избыточные магнитные шарики также будут адсорбировать больше примесей, что имеет большое влияние на эффект удаления примесей. Даже иногда слишком много магнитных шариков адсорбируют протеазу, лизоцим и другие функциональные компоненты, которые играют важную роль в жидкой системе, что приводит к низкой эффективности всего набора. Во многих случаях, когда эффект экстракции плохой, уменьшение количества используемых магнитных шариков — лучший способ улучшить эффект экстракции.
Обычно количество эталонных магнитных шариков, выдаваемых набором для метода магнитных шариков, немного превышает норму. Следовательно, нет необходимости часто увеличивать количество магнитных шариков для повышения эффективности адсорбции. Однако, если будет определено, что количество магнитных шариков недостаточное, эффект извлечения не будет хорошим. Что ж, можно улучшить эффект извлечения, увеличив количество магнитных шариков в определенном диапазоне.

Недоразумение 2. Чем больше используется реагентов, тем лучше эффект экстракции.

Однако для метода магнитных шариков каждое увеличение объема части жидкости снижает вероятность большего количества столкновений магнитных шариков, а уменьшение вероятности столкновений магнитных шариков приведет к значительному падению скорости адсорбции. Следовательно, во многих случаях, хотя добавление раствора для лизиса и промывочного раствора действительно может усилить лизис и улучшить отмывку, суть экстракции магнитных гранул — это эффективность адсорбции нуклеиновых кислот магнитными гранулами. Эффективность столкновения магнитных шариков не может быть гарантирована, но эффективность экстракции нуклеиновой кислоты не может быть гарантирована. Да, поэтому простое увеличение количества реагентов, используемых для улучшения эффекта экстракции, может быть не полностью эффективным.

Недоразумение 3. Чем больше время стирки, тем лучше эффект отжима.

Если в экстрагированной нуклеиновой кислоте слишком много примесей, пользователь может подумать о промывке несколько раз, чтобы получить более чистую нуклеиновую кислоту. Увеличение количества промывок действительно способствует очистке нуклеиновых кислот, но, учитывая, что каждая промывка будет терять определенное количество нуклеиновой кислоты и увеличивать вероятность фрагментации и гидролиза нуклеиновой кислоты, обычно целесообразно контролировать количество промывок на От 2 до 4 раз.

Недоразумение 4. Чем больше образцов используется, тем лучше эффект извлечения.

Когда образец недостаточно свежий или само содержание нуклеиновой кислоты низкое, эффект экстракции нуклеиновой кислоты часто бывает плохим, и многие учителя будут использовать несколько образцов для увеличения количества экстракции нуклеиновой кислоты.
Однако простое увеличение объема отбора пробы может иногда привести к появлению слишком большого количества примесей, превышающих лизирующую способность лизата, а также к снижению эффективности экстракции. Поэтому не рекомендуется просто увеличивать объем отбора пробы для достижения цели увеличения объема экстракции.
Если объем экстракции действительно слишком мал из-за недостаточного объема пробы, рекомендуется перед началом экстракции пройти этап обогащения или концентрирования. Или увеличение полноты лизиса и раскрытие большего количества нуклеиновых кислот также является решением.

Недоразумение 5. Если определенный вид магнитного шарика хорош, ондолжен быть эффективным во всех тестах.

Существует много типов магнитных шариков, разный размер частиц, разная дисперсия, разное время магнитного отклика, разная базовая матрица покрытия, разная внешняя модифицированная функциональная группа, разная плотность покрытия, разная длина плеча функциональной группы, что приводит к появлению магнитных шариков. .
Следовательно, эксперименты и системы, к которым приспосабливаются разные магнитные шарики, также различны. Так же, как реагенты для экстракции нуклеиновых кислот, формулы не совсем такие же, и свойства магнитных шариков, которые также используются для экстракции нуклеиновых кислот, не совсем такие же.
Некоторые магнитные шарики показывают более высокую эффективность адсорбции при экстракции постоянной нуклеиновой кислоты, а некоторые магнитные шарики более подходят для экстракции следов нуклеиновой кислоты. Некоторые магнитные шарики подходят для более кислых систем реагентов, а некоторые магнитные шарики подходят для более щелочных систем реагентов. Некоторые магнитные шарики обладают хорошей магнитной чувствительностью, но высокой скоростью оседания, что больше подходит для автоматического экстрактора с магнитным стержнем; некоторые магнитные шарики имеют медленную скорость оседания, но длительное время магнитного отклика, и больше подходят для автоматического экстрактора пипеточного типа.
Редко бывает что-то вроде магнитных бусинок, которые можно было бы применить во всех экспериментальных ситуациях. За исключением фиксированного набора, в большинстве случаев магнитные шарики и систему реагентов необходимо регулировать в течение определенного периода времени.

Недоразумение 6. Нехорошо сравнивать с определенным комплектом, то есть магнитные бусины не годятся

В процессе проверки магнитных шариков многие клиенты просто заменяют магнитные шарики на такое же количество под зрелой системой реагентов, чтобы сравнить эффекты магнитных шариков.
Таким образом, легко сделать вывод, что определенные магнитные шарики неэффективны, но на самом деле, поскольку разные магнитные шарики подходят для разных систем и дозировок, их часто необходимо отрегулировать для получения лучших результатов экстракции.

Набор для экстракции нуклеиновых кислот — это высокотехнологичный продукт, сочетающий биологическую науку и науку о наноматериалах. Это крупный прорыв в технологии экстракции и очистки нуклеиновых кислот. С быстрым развитием генетической диагностики, обнаружения генетически модифицированных пищевых продуктов, персонализированной медицины и т. Д. Текущая технология экстракции нуклеиновых кислот больше не может удовлетворять потребности современной биотехнологии, и существует острая потребность в высокопроизводительной и автоматизированной нуклеиновой кислоте. метод экстракции. В этом контексте появился набор для экстракции нуклеиновых кислот (метод магнитных шариков). Затем редактор Aisen познакомит вас с основными компонентами набора для экстракции нуклеиновых кислот.

1, лаурилсульфат натрия

Лаурилсульфат натрия представляет собой органическое вещество, белый или светло-желтый порошок, растворимый в воде, нечувствительный к щелочам и жесткой воде. Обладает обеззараживанием, эмульгированием и отличной пенообразующей способностью. Это анионное поверхностно-активное вещество, которое слабо токсично для человеческого организма, и его биоразлагаемость составляет> 90%.

Он может разрывать водородные связи внутри и между молекулами, разворачивать молекулы, разрушать вторичную и третичную структуру молекул белка, денатурировать белок и разрушать связывание белка и нуклеиновой кислоты при высокой температуре, а также способствовать высвобождению нуклеиновой кислоты.

2, этилфенилполиэтиленгликоль

Этилфенилполиэтиленгликоль сокращенно обозначается как NP-40, это очень мягкий неионный детергент, часто используемый при лизисе клеток, обработке белков, гистохимической обработке, гибридной промывке и т. Д. Концентрация 1% может в основном разрушить клеточную мембрану, но повреждение ядерной мембраны слабое.

3, слабая хелатирующая смола катионов

Хелатирующая смола со слабыми катионами представляет собой химическую хелатирующую смолу, состоящую из сополимера стирола и дивинилбензола, содержащую пары иминодиацетат-ионов, которые могут хелатировать многовалентные ионы, особенно для ионов высоковалентных металлов. Очень высокое сродство и хелатирование. В условиях низкой ионной силы, щелочности и кипения клеточная мембрана может быть разорвана, а белок денатурирован. Частицы Chelex удаляются центрифугированием, и связанный материал отделяется от ДНК.

4, протеиназа К

— мощный протеолитический фермент, выделенный из Candida albicans. Он обладает высокой удельной активностью и является ключевым реагентом для выделения ДНК. При экстракции ДНК основная функция заключается в ферментативном разложении гистонов, связанных с нуклеиновыми кислотами, так что ДНК высвобождается в растворе.

5, полиэтиленгликоль октилфениловый эфир

Октилфениловый эфир полиэтиленгликоля обозначается аббревиатурой Triton X-100. Это неионогенное поверхностно-активное вещество. Он не диссоциирует в воде, имеет высокую стабильность в растворе и не подвержен действию сильных неорганических солей электролита. Соединяется с липидами, такими как фосфолипиды, в биологических мембранах с образованием растворимых комплексов; гидрофобный конец может также объединяться с гидрофобными участками мембранных белков с образованием комплексов и растворением в растворе.

6, гуанидин изотиоцианат

Гуанидин изотиоцианат — это мощный денатурирующий белок, который может быстро растворять белок и нарушать структуру клетки. Нуклеопротеин быстро отделяется от нуклеиновой кислоты за счет разрушения и исчезновения ее вторичной структуры.

7, этилендиаминтетрауксусная кислота

Этилендиаминтетрауксусная кислота представляет собой органическое соединение, представляющее собой белый порошок при нормальной температуре и давлении. Это хелатирующий агент, который может связываться с ионами двухвалентных металлов. Поскольку для большинства нуклеаз и некоторых протеаз требуются ионы двухвалентных металлов, они часто используются в качестве ингибиторов нуклеаз и протеаз; их также можно использовать для устранения ингибирующего действия ионов тяжелых металлов на ферменты.

Вышесказанное представляет собой введение в основные компоненты набора для экстракции нуклеиновых кислот. Набор для экстракции нуклеиновых кислот использует магнитные шарики для адсорбции ДНК / РНК для достижения цели быстрой очистки ДНК / РНК, и вышеупомянутые химические компоненты играют важную роль в этом процессе. Набор для экстракции нуклеиновых кислот методом магнитных шариков, разработанный и произведенный Aisen Biotechnology, надежен по качеству, удобен в использовании и обладает превосходным действием. Нуждающиеся клиенты могут позвонить для консультации.