Принцип экстракции нуклеиновых кислот, во-первых, гарантирует целостность первичной структуры нуклеиновой кислоты, а во-вторых, исключает загрязнение других молекул. При экстракции следует обращать внимание на сокращение времени экстракции, уменьшение разложения нуклеиновой кислоты химическими и физическими факторами, механическим усилием сдвига и высокой температурой, а также предотвращение биологической деградации нуклеиновой кислоты. Какие есть методы экстракции нуклеиновых кислот?

1. концентрированный солевой метод
(1). Используя различную растворимость RNP и DNP в электролитическом растворе для разделения этих двух веществ, общий метод состоит в извлечении слизи DNP, полученной путем экстракции хлорида натрия 1М хлоридом натрия и встряхивания вместе с хлороформом, содержащим небольшое количество октанола, для эмульгирования. и центрифугирование для удаления белка. В это время протеиновый гель остается между водной фазой и фазой хлороформа, в то время как ДНК находится в верхней водной фазе. Натриевая соль ДНК может быть осаждена 2-кратным объемом 95% этанола.

(2). Вы также можете использовать 0,15 M NaCL для многократной промывки раствора для дробления клеток для удаления RNP, затем экстрагировать дезоксирибонуклеин с помощью 1 M NaCL, а затем удалить белок методом хлороформ-изоалкоголь. Сравнивая эти два метода, второй метод может уменьшить деградацию нуклеиновой кислоты.

(3). При извлечении ДНК разбавленным раствором соляной кислоты добавление соответствующего количества детергента, такого как SDS, может помочь отделить белок от ДНК. В процессе экстракции, чтобы ингибировать деградацию ДНК ДНКазой в ткани, цитрат натрия был добавлен к раствору хлорида натрия в качестве агента плавления для ионов металлов, обычно 15 М NaCL, 0,015 М цитрата натрия, и так называемый раствор SSC. для извлечения ДНК.

2. метод анионного моющего средства
Детергенты, такие как SDS или ксилат натрия, используются для денатурирования белков, а ДНК можно экстрагировать непосредственно из биологических материалов. Поскольку ДНК и белок в клетках часто объединяются электростатическим притяжением или координационными связями, анионные детергенты могут это разрушить. Своеобразная валентная связь, поэтому для извлечения ДНК часто используются анионные детергенты.

3. метод экстракции фенола
Фенол действует как денатурант белка и в то же время ингибирует деградацию ДНКазы. Когда гомогенат обрабатывают фенолом, связь между белком и ДНК разрывается, и поверхность молекулы белка содержит много полярных групп, совместимых с фенолом, и молекула белка растворима в феноле. Фаза, при этом ДНК растворима в водной фазе. После центрифугирования и наслаивания удалите водный слой, повторите операцию несколько раз, а затем объедините ДНК-содержащую водную фазу и используйте свойство нерастворимой в спирте нуклеиновой кислоты для осаждения ДНК этанолом. В настоящее время ДНК представляет собой очень вязкое вещество, и ее можно извлечь, обернув ее в шар со стеклом. Особенностью этого метода является сохранение извлеченной ДНК в ее естественном состоянии.

4. метод водной экстракции.
Используя природу нуклеиновой кислоты для растворения в воде, после разрушения тканевых клеток удалите РНК с помощью раствора с низким содержанием соли и растворите осадок в воде, чтобы полностью растворить ДНК в воде. После центрифугирования соберите супернатант и добавьте к супернатанту твердый хлорид натрия. К 2,6 М добавляют в 2 раза больше 95% этанола, немедленно перемешивают, а затем промывают 66%, 80% и 95% этанолом и ацетоном соответственно.

Вышеупомянутое дает краткое введение в методы экстракции нуклеиновых кислот. Ascend предоставляет профессиональные и комплексные услуги по отливке продуктов экстракции нуклеиновых кислот.

Со вспышкой нового коронавируса, хотя он и взят под контроль, все по-прежнему не могут относиться к нему легкомысленно. Каждый должен знать, что все подозреваемые случаи и пациенты с лихорадкой должны пройти тестирование на нуклеиновую кислоту, чтобы подтвердить, являются ли они новыми коронавирусами. Этапы обнаружения нуклеиновых кислот в основном делятся на три этапа:
1. Отбор образцов. Соберите образцы, которые могут содержать вирусы из дыхательных путей или других частей тела человека.
2. Экстракция: извлеките вирусную нуклеиновую кислоту из образца и отделите ее от других веществ.
3. Обнаружение: обнаружение извлеченного вируса методом количественной флуоресцентной ПЦР.
Среди них магнитные шарики являются одним из необходимых инструментов для экстракции нуклеиновых кислот. Итак, каковы классификация и функции магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот?
Классификация и функция магнитных шариков: по свойствам поверхности их можно разделить на следующие три категории.

1. Силиконовые гидрокси-магнитные шарики.
Это один из наиболее широко используемых магнитных шариков. При использовании силанольных магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот обычно требуются высокие концентрации хаотропных солей (NaI, NaClO4, GuHCI, GuSCN и т. Д.). Высокая концентрация солевых ионов может эффективно экранировать электростатическое отталкивание в растворе. В то же время ионы хаотропных солей могут также конкурировать с поверхностью магнитных шариков и молекул нуклеиновой кислоты, разрушать исходный гидратный слой на обеих поверхностях и способствовать адсорбции (водородная связь + сила Ван-дер-Ваальса) между поверхностью магнитных частиц. шарики и молекулы нуклеиновой кислоты. Поскольку обычно используемые хаотропные соли, такие как ионы гуанидина, оказывают ингибирующее действие на ПЦР, их необходимо удалять на последующих этапах промывки. Эффект удаления можно контролировать по коэффициенту поглощения.

2. Карбокси магнитные шарики
Помимо способности связывать молекулы нуклеиновой кислоты в среде с высокой концентрацией хаотропной соли, такие магнитные шарики могут связывать молекулы нуклеиновой кислоты с помощью другого особого механизма. При добавлении в раствор определенной концентрации PEG и NaCl молекулы нуклеиновой кислоты могут постепенно свернуться из вытянутой конформации в форму небольшого шара, и большая часть отрицательных зарядов на ней также экранируется, что способствует адсорбции нуклеиновой кислоты. молекулы кислоты к магнитным шарикам. Чем больше молекулярная масса молекулы нуклеиновой кислоты, тем более вероятно, что произойдет это конформационное изменение от вытянутой спирали до свернутого шарика. Следовательно, регулируя объемное отношение раствора соли к образцу нуклеиновой кислоты, можно получить фрагмент нуклеиновой кислоты с большей молекулярной массой на карбоксильных магнитных шариках. Благодаря преимущественной адсорбции на поверхности достигается так называемый эффект экранирования фрагментов.

3. Амино / имидазолиловые и другие положительно заряженные магнитные шарики.
Такие магнитные шарики могут легко реализовать обратимое связывание молекул нуклеиновой кислоты на поверхности путем регулирования pH. Однако из-за того, что положительно заряженная поверхность слишком сильно адсорбирует молекулы нуклеиновой кислоты, выход легко может быть низким. Следовательно, использование положительно заряженных магнитных шариков не так широко распространено, как силанольные и карбоксильные магнитные шарики.
Классификация и функция магнитных шариков для экстракции нуклеиновых кислот подробно объяснены выше. Aisen использует нанобиомагнитные шарики в качестве ядра для производства экстракторов нуклеиновых кислот и соответствующих им наборов для экстракции нуклеиновых кислот на магнитных шариках.

Система экстракции нуклеиновых кислот — это инструмент, в котором используются соответствующие реагенты для экстракции нуклеиновых кислот для автоматического завершения экстракции нуклеиновых кислот из образца. Метод магнитных шариков заключается в лизисе образца клеточной ткани через раствор для лизиса, молекулы нуклеиновой кислоты, свободные от образца, специфически адсорбируются на поверхности магнитных частиц, а примеси, такие как белки, не адсорбируются, а остаются в растворе. Магнитные шарики, несущие нуклеиновую кислоту, адсорбируются магнитным стержнем и перемещаются в разные резервуары для реагентов. В конечном итоге чистую нуклеиновую кислоту получают многократным быстрым перемешиванием и смешиванием жидкости, лизисом клеток, адсорбцией нуклеиновой кислоты, промывкой и элюированием и другими стадиями.

Использование системы извлечения нуклеиновых кислот с помощью магнитных шариков

Обычно существует два способа использования системы экстракции нуклеиновых кислот методом магнитных шариков, а именно метод магнитного стержня и метод всасывания. Ниже мы подробно объясним конкретные операции метода магнитных стержней и метода всасывания.

1. Магнитно-стержневой метод.

Метод магнитных стержней использует перенос магнитных шариков и иммобилизацию жидкостей для разделения нуклеиновых кислот. Принцип и процесс такие же, как и у метода всасывания. Есть разница в разделении магнитных шариков и жидкости. Метод магнитного стержня заключается в том, чтобы отделить магнитные шарики от отработанной жидкости посредством адсорбции магнитных шариков на магнитном стержне и поместить их в жидкость на следующем этапе для реализации экстракции нуклеиновой кислоты.

2. Метод всасывания

Метод всасывания также называется методом пипетирования, который использует перенос жидкости или иммобилизацию магнитных шариков для извлечения нуклеиновой кислоты. Передача обычно осуществляется с помощью манипулятора управления системой, а процесс извлечения выглядит следующим образом:

1) Растрескивание

Добавьте лизат к образцу, используйте механическое движение и нагревание, чтобы перемешать реакционный раствор и завершить реакцию. Лизируйте клетку, чтобы высвободить нуклеиновую кислоту.

2) Адсорбция

Добавьте магнитные шарики к образцу лизирующего раствора, хорошо перемешайте и используйте магнитные шарики, чтобы иметь сильное сродство к нуклеиновым кислотам при высоких значениях соли и низких значениях pH. Магнитные шарики могут адсорбировать нуклеиновые кислоты. Под действием внешнего магнитного поля отделите магнитные шарики от раствора. Перенесите наконечник в бак для отходов и выбросьте наконечник.

3) Стирка

Уберите внешнее магнитное поле, используйте новый наконечник для добавления промывочного буфера, хорошо перемешайте, удалите примеси и удалите жидкость под действием внешнего магнитного поля.

4) Элюция

Удалите внешнее магнитное поле, добавьте буфер для элюции с новым наконечником, тщательно перемешайте, и связанная нуклеиновая кислота отделяется от магнитных шариков, так что получается очищенная нуклеиновая кислота.

Меры предосторожности

1. Система экстракции нуклеиновой кислоты находится на расстоянии не менее 10 см от других вертикальных поверхностей.

2. Входной шнур питания прибора должен быть заземлен во избежание поражения электрическим током.

3. Оператору не разрешается разбирать прибор без разрешения, и он должен иметь квалифицированный профессиональный обслуживающий персонал для выполнения замены компонентов или выполнения внутренних регулировок и других операций. Когда питание включено, не заменяйте компоненты.

4. Относительная влажность составляет 10% -80%, воздух без препятствий составляет 35 ℃ или ниже, нормальное атмосферное давление (высота должна быть ниже 3000 м), температура 20-35 ℃, а типичная температура использования 25 ℃ — это среда установки прибора.

5. Не размещайте инструмент рядом с источником тепла, например, электронагревателем. Избегайте попадания воды или других жидкостей на электронные компоненты, чтобы избежать коротких замыканий.

6. Как входное, так и выходное отверстие для воздуха расположены на задней панели прибора и в то же время предотвращают накопление пыли или волокон на входе для воздуха и не препятствуют засорению воздуховода.

В настоящее время экстрактор нуклеиновой кислоты методом магнитных шариков широко используется в различных областях, таких как обнаружение микробов в окружающей среде, обнаружение безопасности пищевых продуктов, безопасность переливания крови, идентификация судебной медицины, центр контроля заболеваний, клиническая диагностика заболеваний, биологические исследования и животноводство.

Нуклеиновая кислота — носитель генетической информации, важнейшая молекула биологической информации и главный объект исследований молекулярной биологии. Таким образом, экстракция нуклеиновой кислоты является наиболее важной и основной операцией в экспериментальной технологии молекулярной биологии.

Нуклеиновая кислота делится на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). РНК можно разделить на рибосомную РНК (рРНК), информационную РНК (мРНК) и транспортную РНК (тРНК) в соответствии с их функциями.

ДНК в основном сосредоточена в ядре, митохондриях и хлоропластах, в то время как РНК в основном распределена в цитоплазме.

В нуклеиновых кислотах пуриновые и пиримидиновые основания имеют конъюгированные двойные связи, поэтому нуклеиновые кислоты обладают характеристиками поглощения ультрафиолета. Ультрафиолетовое поглощение натриевой соли ДНК составляет около 260 нм, а ее поглощение представлено как A260. Он находится в впитывающем желобе на 230 нм, поэтому можно использовать ультрафиолетовую спектроскопию. Фотометр выполняет количественное и качественное определение нуклеиновых кислот.

Нуклеиновая кислота — это амфотерный электролит, который эквивалентен поликислоте. Нейтральный или щелочной буфер можно использовать для диссоциации нуклеиновой кислоты на анионы, которые помещаются в электрическое поле и движутся к аноду. Это принцип электрофореза.

Принципы и требования экстракции и очистки нуклеиновых кислот

1. Обеспечить целостность первичной структуры нуклеиновой кислоты;

2. Устранение загрязнения от других молекул (например, устранение вмешательства РНК при извлечении ДНК);

3. Не должно быть органических растворителей и высоких концентраций ионов металлов, которые могут ингибировать ферменты в образцах нуклеиновых кислот;

4. Сведите к минимуму макромолекулярные вещества, такие как белки, полисахариды и липиды, насколько это возможно.

Тип экстракции нуклеиновой кислоты

1. Извлечение общей РНК

Из общей РНК 75-85% составляет рРНК (в основном 28S-26S / 23S и 18S / 16S рРНК), а остальная часть состоит из мРНК и малых РНК с разными молекулярными массами и нуклеотидными последовательностями, такими как тРНК, 5S рРНК, 5,8S. рРНК, миРНК, миРНК, малая ядерная РНК (малая ядерная РНК, мяРНК) и малая ядрышковая РНК (малая ядерная РНК, мяРНК) и другие компоненты.

2. извлечение miRNA

МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие высококонсервативные молекулы РНК, такие как малые интерферирующие РНК (миРНК), которые регулируют экспрессию своих гомологичных молекул мРНК путем спаривания с ними оснований для предотвращения экспрессии с помощью различных механизмов. Они стали ключевым органом регулирования развития, пролиферации, дифференциации и клеточного цикла клеток.

3. Извлечение геномной ДНК

Для исследования структуры и функции генов и диагностики генов обычно требуется, чтобы длина полученного фрагмента была не менее 100-200kb. В процессе выделения ДНК следует избегать различных факторов, вызывающих фрагментацию и деградацию ДНК, насколько это возможно, чтобы гарантировать целостность ДНК и заложить основу для последующих экспериментов.

4. Экстракция плазмиды

Метод экстракции плазмиды заключается в удалении РНК, отделении плазмиды от бактериальной геномной ДНК и удалении белков и других примесей для получения относительно чистой плазмиды.

Метод экстракции и очистки нуклеиновых кислот

1. Метод экстракции фенолом / хлороформом.

Изобретенный в 1956 году после обработки фенолом / хлороформом жидкости для дробления клеток или гомогената ткани, компоненты нуклеиновых кислот, состоящие в основном из ДНК, растворяются в водной фазе, а липиды в основном содержатся в органической фазе, а белки находятся между двумя фазами.

2. Метод осаждения спиртом.

Этанол может устранить гидратный слой нуклеиновой кислоты и обнажить отрицательно заряженные фосфатные группы. Положительно заряженные ионы, такие как NA ﹢, могут объединяться с фосфатными группами с образованием осадка.

3. Метод хроматографической колонки.

Благодаря специальному адсорбционному материалу с кремниевой матрицей ДНК может специфически адсорбироваться, а РНК и белок могут проходить через нее плавно, а затем использовать высокую соль и низкий pH для связывания нуклеиновой кислоты, а также элюирование с низким содержанием соли и высоким pH для разделения и очистки нуклеиновой кислоты.

4. Щелочной метод термического крекинга.

Щелочная экстракция в основном использует топологическую разницу между ковалентно закрытыми кольцевыми плазмидами и линейным хроматином для их разделения. В щелочных условиях денатурированные белки растворимы.

5. Метод кипячения и крекинга.

Нагрейте раствор ДНК, чтобы использовать характеристики линейных молекул ДНК для отделения фрагментов ДНК от осадка, образованного денатурированными белками и клеточными остатками, центрифугированием.

6. Метод наномагнитных шариков.

Поверхность суперпарамагнитных наночастиц модифицируется и модифицируется с помощью нанотехнологий для получения наномагнитных шариков из суперпарамагнитного оксида кремния. Магнитные шарики могут специфически распознавать и эффективно объединяться с молекулами нуклеиновой кислоты на микроскопической поверхности раздела. Используя суперпарамагнетизм наносфер кремнезема, под действием хаотропных солей (гидрохлорид гуанидина, изотиоцианат гуанидина и др.) И внешнего магнитного поля ДНК и РНК отделяются от крови, тканей животных, продуктов питания, патогенных микроорганизмов и других образцов.

7. Другие методы

В дополнение к вышеупомянутым обычно используемым методам существует множество методов, таких как ультразвук, многократное замораживание и оттаивание, ферментативный гидролиз и гипотонический лизис.

Новое исследование, опубликованное в журнале Nature, показало, что существует связь между церебральным параличом и генетической изменчивостью. Это удивительное открытие ставит под сомнение утверждение, что факторы окружающей среды являются единственной причиной церебрального паралича.

По словам соавтора исследования Стивена Шерера, многие люди поначалу не были оптимистичны по поводу этого исследования, потому что в течение многих лет считалось, что гены не влияют на церебральный паралич.

Изучив гены 115 детей с церебральным параличом и их родителей, исследователи обнаружили, что у 10% этих детей были хромосомные аномалии. Шерер сказал, что 10% — очень значительное соотношение, и это открытие очень шокирует.

По словам исследователей, проблема с геном ребенка с мутацией находится в области вариации числа копий.

Понятно, что вариация количества копий относится к увеличению или уменьшению количества копий больших фрагментов генома длиной более 1 т.п.н. Вариация приведет к тому, что у обоих родителей скопируется только одна или три копии гена. Один из генов может быть удален или скопирован дополнительно.

Шерер сказал, что у всех есть вариации количества копий, но у детей, участвовавших в исследовании, есть много вариаций количества копий, которые затрагивают от десятков до сотен генов. До этого ученые всегда считали, что церебральный паралич, распространенное заболевание, вызывающее физические недостатки у детей, вызывается инфекциями или инсультами, которые возникают у младенцев во время беременности или при родах. Люди будут учитывать генетические факторы только тогда, когда нет очевидного воздействия на окружающую среду. .

В настоящее время исследователи считают, что генетическое тестирование также должно стать стандартным методом тестирования, чтобы помочь родителям выявлять отклонения у своих детей и рано обнаруживать другие заболевания.