¿Cuáles son los métodos de extracción de ácidos nucleicos?
El ácido nucleico es el portador de información genética, la molécula de información biológica más importante y el principal objeto de la investigación en biología molecular. Por tanto, la extracción de ácidos nucleicos es la operación más importante y básica en la tecnología experimental de biología molecular.
El ácido nucleico se divide en ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). El ARN se puede dividir en ARN ribosómico (ARNr), ARN mensajero (ARNm) y ARN de transferencia (ARNt) según sus funciones.
El ADN se concentra principalmente en el núcleo, las mitocondrias y los cloroplastos, mientras que el ARN se distribuye principalmente en el citoplasma.
En los ácidos nucleicos, las bases de purina y las bases de pirimidina tienen dobles enlaces conjugados, por lo que los ácidos nucleicos tienen características de absorción ultravioleta. La absorción ultravioleta de la sal sódica del ADN es de alrededor de 260 nm y su absorbancia está representada por A260. Está en el canal de absorción a 230 nm, por lo que se puede utilizar la espectroscopia ultravioleta. El fotómetro realiza la determinación cuantitativa y cualitativa de ácidos nucleicos.
El ácido nucleico es un electrolito anfótero, que es equivalente a un poliácido. Se puede usar un tampón neutro o alcalino para disociar el ácido nucleico en aniones, que se colocan en un campo eléctrico y se mueven hacia el ánodo. Este es el principio de la electroforesis.
Principios y requisitos de la extracción y purificación de ácidos nucleicos.
1. Asegurar la integridad de la estructura primaria del ácido nucleico;
2. Eliminar la contaminación de otras moléculas (como eliminar la interferencia de ARN al extraer ADN);
3. No debe haber disolventes orgánicos y altas concentraciones de iones metálicos que puedan inhibir las enzimas en las muestras de ácido nucleico;
4. Minimizar al máximo las sustancias macromoleculares como proteínas, polisacáridos y lípidos.
Tipo de extracción de ácido nucleico
1. Extracción de ARN total
Del ARN total, el 75-85% es ARNr (principalmente ARNr 28S-26S / 23S y 18S / 16S), y el resto está formado por ARNm y ARN pequeño con diferentes pesos moleculares y secuencias de nucleótidos como ARNt, ARNr 5S, 5.8S ARNr, miARN, ARNip, ARN nuclear pequeño (ARN nuclear pequeño, ARNnn) y ARN nucleolar pequeño (ARN nuceolar pequeño, ARNsno) y otros componentes.
2. extracción de miARN
Los microARN (miARN) son moléculas de ARN pequeñas y altamente conservadas, como los ARN de interferencia pequeños (ARNip), que regulan la expresión de sus moléculas de ARNm homólogas mediante el emparejamiento de bases con ellas para evitar la expresión a través de varios mecanismos. Se han convertido en una agencia reguladora clave para el desarrollo, la proliferación celular, la diferenciación y el ciclo celular.
3. Extracción de ADN genómico
Para la investigación de la estructura y función de los genes y el diagnóstico de genes, generalmente se requiere que la longitud del fragmento obtenido no sea inferior a 100-200 kb. En el proceso de extracción de ADN, se deben evitar en la medida de lo posible varios factores que causan la fragmentación y degradación del ADN para garantizar la integridad del ADN y sentar las bases para experimentos posteriores.
4. Extracción de plásmidos
El método de extracción de plásmidos consiste en eliminar el ARN, separar el plásmido del ADN genómico bacteriano y eliminar las proteínas y otras impurezas para obtener un plásmido relativamente puro.
Método de extracción y purificación de ácidos nucleicos.
1. Método de extracción de fenol / cloroformo
Inventado en 1956, después del tratamiento con fenol / cloroformo de un líquido triturador de células o un homogeneizado de tejidos, los componentes del ácido nucleico compuestos principalmente por ADN se disuelven en la fase acuosa, y los lípidos están contenidos principalmente en la fase orgánica y las proteínas se encuentran entre las dos fases.
2. Método de precipitación de alcohol
El etanol puede eliminar la capa de hidratación de ácido nucleico y exponer los grupos fosfato cargados negativamente. Los iones cargados positivamente como NA ﹢ pueden combinarse con los grupos fosfato para formar un precipitado.
3. Método de columna de cromatografía
A través del material especial de adsorción de matriz de silicio, el ADN se puede adsorber específicamente, y el ARN y la proteína pueden pasar sin problemas, y luego usar alto contenido de sal y bajo pH para unir el ácido nucleico, y elución de bajo contenido de sal y alto pH para separar y purificar el ácido nucleico.
4. Método alcalino de craqueo térmico
La extracción alcalina utiliza principalmente la diferencia topológica entre plásmidos circulares covalentemente cerrados y cromatina lineal para separarlos. En condiciones alcalinas, las proteínas desnaturalizadas son solubles.
5. Método de agrietamiento por ebullición
Calentar la solución de ADN para utilizar las características de las moléculas de ADN lineales para separar los fragmentos de ADN del precipitado formado por proteínas desnaturalizadas y restos celulares por centrifugación.
6. Método de cuentas nano magnéticas
La superficie de las nanopartículas superparamagnéticas es modificada y modificada por nanotecnología para preparar perlas nanomagnéticas de óxido de silicio superparamagnéticas. Las perlas magnéticas pueden reconocer específicamente y combinarse eficientemente con moléculas de ácido nucleico en la interfaz microscópica. Utilizando el superparamagnetismo de nanoesferas de sílice, bajo la acción de sales caotrópicas (clorhidrato de guanidina, isotiocianato de guanidina, etc.) y un campo magnético externo, se separan ADN y ARN de sangre, tejidos animales, alimentos, microorganismos patógenos y otras muestras.
7. Otros métodos
Además de los métodos comúnmente usados mencionados anteriormente, existen múltiples métodos tales como ultrasonidos, congelación y descongelación repetidas, hidrólisis enzimática y lisis hipotónica.
