¿Cuáles son los principios de la extracción y purificación de ácidos nucleicos?

La extracción de ácidos nucleicos se utiliza en pruebas y diagnósticos bioquímicos moleculares y es el primer paso de la clonación, transformación, digestión enzimática, transcripción in vitro, amplificación y secuenciación. Sin embargo, debido a la gran cantidad de proteínas, carbohidratos, metabolitos y otros contaminantes en la muestra original, no es fácil extraer ácidos nucleicos de alta calidad, es necesario aplicar el sistema de extracción de ácidos nucleicos de apoyo y los reactivos de extracción de ácidos nucleicos para completar automáticamente la extracción del ácido nucleico de la muestra.

Principios de extracción y purificación de ácidos nucleicos.
1. Debe garantizarse la integridad de la estructura primaria del ácido nucleico;
2. Elimina la contaminación de otras moléculas.
Para asegurar el estudio de la estructura y función del ácido nucleico, una estructura primaria completa es el requisito más básico, porque la información genética se almacena en la estructura primaria, y la estructura primaria del ácido nucleico también determina la forma de su alto nivel. estructura y otras macromoléculas biológicas. La forma de combinación. La purificación del ácido nucleico debe cumplir los tres requisitos siguientes:
1. No hay disolventes orgánicos y concentraciones excesivamente altas de iones metálicos que puedan inhibir las enzimas en las muestras de ácido nucleico;
2. Debe minimizarse la contaminación de otras macromoléculas biológicas como proteínas, polisacáridos y moléculas lipídicas;
3. Eliminar la contaminación de otras moléculas de ácido nucleico, como el ARN que se debe eliminar al extraer moléculas de ADN, y viceversa.

Para garantizar la integridad y pureza del ácido nucleico aislado, se deben tener en cuenta los siguientes elementos durante el experimento:
1. Intente simplificar los pasos operativos y acortar el proceso de extracción para reducir el daño de varios factores nocivos al ácido nucleico;
2. Reducir la degradación de ácidos nucleicos por factores químicos Para evitar daños al enlace fosfodiéster en la cadena de ácido nucleico por sobreácido y sobre base, la operación se lleva a cabo principalmente bajo la condición de pH 4-10;
3. Reducir la degradación de los ácidos nucleicos por factores físicos El principal factor de degradación física es la fuerza de cizallamiento mecánica, seguida de la alta temperatura.
La fuerza de corte mecánica incluye agitación y agitación de la solución fuerte y de alta velocidad para hacer que la solución pase rápidamente a través de los poros estrechos y largos, las células se colocan repentinamente en la solución hipotónica, las células explotan explosivamente y las muestras de ADN se congelan y almacenan repetidamente Se debe prestar atención a estos detalles operativos en la operación experimental El principal peligro del cizallamiento mecánico son las moléculas de ADN lineales con grandes pesos moleculares, como el ADN cromosómico de las células eucariotas.
La amenaza para las moléculas de ADN circulares con pesos moleculares pequeños, como las moléculas de ADN y ARN de plásmido, es relativamente pequeña. La temperatura alta es como hervir durante mucho tiempo. Además de la fuerza de cizallamiento causada por el agua hirviendo, la temperatura alta también puede dañar algunos enlaces químicos en moléculas de ácido nucleico. En el proceso de extracción de ácido nucleico, generalmente se opera a baja temperatura, pero ahora se encuentra que no hay mucha diferencia en la calidad del ácido nucleico obtenido a temperatura ambiente extracción rápida y baja extracción de temperatura.
4. Para prevenir la biodegradación de los ácidos nucleicos, varias nucleasas dentro o fuera de la célula digieren el enlace fosfodiéster en la cadena de ácidos nucleicos y destruyen directamente la estructura primaria del ácido nucleico. Entre ellas, las enzimas del ADN requieren la activación de iones divalentes metálicos Mg2 y Ca2. El uso de EDTA y citrato para quelar iones divalentes de metales puede inhibir básicamente la actividad de la DNasa. La RNasa no solo se distribuye ampliamente, contamina fácilmente la muestra, sino que también es resistente a altas temperaturas, ácidos, álcalis y no es fácil de inactivar, por lo que es el principal factor de peligro en el proceso de extracción de ARN biodegradable.
Los pasos principales de la extracción de ácidos nucleicos no son más que alterar las células, eliminar proteínas unidas a ácidos nucleicos, polisacáridos, lípidos y otras macromoléculas biológicas, eliminar otras moléculas de ácidos nucleicos no deseados, precipitar ácidos nucleicos, eliminar sales, disolventes orgánicos y otras impurezas, y purificación de ácidos nucleicos Espere. El esquema de extracción de ácidos nucleicos debe determinarse de acuerdo con las características del material biológico específico y las moléculas de ácido nucleico a extraer. Para las moléculas de ácido nucleico enriquecidas en un orgánulo específico, el esquema de extracción del orgánulo de antemano y luego extraer la molécula de ácido nucleico diana puede obtener completitud y moléculas de ácido nucleico con alta pureza y alta calidad.