¿Cuáles son las tecnologías de purificación de ácidos nucleicos?
En la actualidad, las tecnologías de purificación de ácidos nucleicos ampliamente utilizadas en la investigación científica se pueden dividir en dos categorías: las que utilizan medios y las que no utilizan medios. Si se utilizan medios, el ácido nucleico se separa de todas las demás impurezas al mismo tiempo; si no se utilizan medios, el primer paso es separar el ácido nucleico de todas las demás impurezas. El ácido nucleico y la sal se separan de las impurezas macromoleculares y el ácido nucleico se separa de la sal por precipitación del ácido nucleico.
1) Tecnología de purificación clásica mediante extracción con fenol / cloroformo
Después de lisar las células, la fase acuosa que contiene el ácido nucleico se separa por centrifugación y se añade un volumen igual de mezcla de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (volumen 25: 24: 1). De acuerdo con el propósito de la aplicación, las dos fases se agitan y mezclan (adecuadas para la separación de ácidos nucleicos de bajo peso molecular) o simplemente se invierten y mezclan (adecuadas para la separación de ácidos nucleicos de alto peso molecular) y luego se centrifugan. Las proteínas hidrófobas se dividen en la fase orgánica y los ácidos nucleicos se retienen en la fase acuosa superior.
El fenol es un disolvente orgánico. Debe estar saturado con tampón STE de antemano. El fenol insaturado absorberá la fase acuosa y eliminará una parte del ácido nucleico. El fenol también es fácil de oxidar y se vuelve amarillo, y el fenol oxidado puede hacer que el enlace fosfodiéster en la cadena de ácido nucleico rompa o reticule la cadena de ácido nucleico; por lo tanto, se debe agregar una sustancia especial al preparar la solución saturada de fenol para evitar la oxidación del fenol. El cloroformo puede eliminar la grasa y desnaturalizar más proteínas, mejorando así la eficiencia de extracción. El alcohol isoamílico puede reducir las burbujas generadas durante el funcionamiento.
La sal de ácido nucleico puede precipitarse con algunos disolventes orgánicos, el ácido nucleico puede concentrarse por precipitación, el tipo de tampón de disolución de ácido nucleico se puede cambiar y algunas moléculas de impurezas pueden eliminarse. Un ejemplo típico es la precipitación con etanol después de la extracción con fenol y cloroformo. Después de añadir un pH de 5,0 a 5,5 en la fase acuosa que contiene ácido nucleico, la concentración final de NaAc o KAc a una concentración final de 0,3 M neutralizará los iones de sodio en la cadena principal de fosfato de ácido nucleico. La carga negativa promueve la renaturalización hidrófoba de ácidos nucleicos en un ambiente ácido. Luego agregue de 2 a 2.5 veces el volumen de etanol, después de un cierto período de incubación, el ácido nucleico puede precipitarse de manera efectiva. Algunos otros disolventes orgánicos (isopropanol, polietilenglicol (PEG), etc.) y sales (acetato de amonio 10.0mol / L, cloruro de litio 8.0mol / L, cloruro de magnesio y cloruro de zinc de baja concentración, etc.)) También se utilizan para la precipitación de ácidos nucleicos.
2) Tecnología de purificación con medios de intercambio iónico
El lisado se pasa a través de la columna y el ácido nucleico se une al medio de intercambio iónico; después del lavado para eliminar las impurezas residuales, el ácido nucleico se eluye del medio con un tampón con alto contenido de sal. Después de la precipitación estándar con etanol / isopropanol, lavado con etanol, secado y otras operaciones, se obtiene el ácido nucleico puro y se disuelve en un tampón adecuado.
3) Tecnología de purificación mediante medios de adsorción.
El lisado se pasa a través de la columna y el medio de adsorción adsorbe selectivamente el ácido nucleico; después del lavado para eliminar las impurezas residuales, el ácido nucleico se eluye del medio con agua o un tampón de bajo contenido de sal adecuado, y se puede utilizar directamente en experimentos posteriores.
4) Centrifugación en gradiente de densidad
La centrifugación en gradiente de densidad también se utiliza para la separación y análisis de ácidos nucleicos. El ADN bicatenario, el ADN monocatenario, el ARN y las proteínas tienen diferentes densidades, por lo que se pueden formar zonas de muestras puras de diferentes densidades mediante centrifugación en gradiente de densidad. Este método es adecuado para la preparación de un gran número de muestras de ácido nucleico, en las que se considera que la centrifugación en equilibrio de gradiente de huso de cloruro de cesio 2 bromuro de etilo es el método preferido para la purificación de grandes cantidades de ADN plasmídico. El cloruro de cesio es el medio estándar para la centrifugación en gradiente de densidad de ácido nucleico. El bromuro de etidio en la solución en gradiente se combina con el ácido nucleico. La zona de ácido nucleico formada después de la centrifugación se irradia con una lámpara ultravioleta para producir fluorescencia y ser detectada. La diálisis o precipitación con etanol elimina el cloruro de cesio para obtener ácido nucleico purificado.
Evaluación de métodos de purificación.
PC (P es la abreviatura de fenol en inglés, C es la abreviatura de cloroformo en inglés) El método de extracción / precipitación con alcohol es un método que nunca estará desactualizado. Estable, confiable, económico y conveniente. La extracción con PC puede eliminar completamente las proteínas y la precipitación con alcohol puede eliminar las sales. Para muestras limpias ordinarias (las impurezas son proteínas), este método puede obtener ácidos nucleicos de alta calidad por completo. Aunque cada extracción de PC perderá una parte del ácido nucleico (porque es imposible eliminar toda la fase acuosa), y la baja concentración de ácido nucleico, la eficiencia de precipitación de alcohol es baja, pero estos problemas pueden resolverse mediante ajustes operativos o reduciendo el impacto.
El mayor problema de este método es que no es adecuado para la extracción a gran escala. La extracción de PC es un medio muy eficaz para eliminar proteínas. El fenol puede desnaturalizar la proteína, y la proteína desnaturalizada se separa de la fase acuosa, en el fenol o entre la fase fenol / agua. La clave para la extracción de PC es mezclar bien y usar lo suficiente. Una mezcla completa puede asegurar un contacto suficiente entre el fenol y la proteína y desnaturalizar completamente la proteína. A muchas personas siempre les preocupa si la mezcla violenta dañará los ácidos nucleicos, especialmente el ADN genómico. De hecho, no hay necesidad de tener tanto cuidado.
Una operación de mezcla vigorosa interrumpirá parcialmente el ADN genómico de moléculas grandes, pero el daño no será tan fuerte como para que el ADN se convierta en un pequeño fragmento dentro de los 10 kb. Después de agitar y mezclar vigorosamente, la mayoría de los fragmentos de ADN genómico tendrán un tamaño superior a 20 kb. Este tamaño, excepto por algunos requisitos especiales, es completamente adecuado para PCR y digestión de restricción. Si los fragmentos requeridos son muy grandes, como para construir una biblioteca, no puede usar un método de mezcla violento, solo se invierte suavemente y se mezcla hacia adelante y hacia atrás.
La clave en este momento es: la proporción de la solución de lisis debe ser lo suficientemente grande para que el sistema no sea demasiado viscoso. La cantidad debería ser suficiente porque el fenol tiene un cierto grado de saturación para eliminar las proteínas. Si se excede la saturación, la proteína en el sistema de lisis no se eliminará de una vez y se debe extraer varias veces antes de que se pueda eliminar por completo. Además, la desventaja de que el sistema sea demasiado viscoso es que la proteína es difícil de eliminar por completo y el ADN genómico se romperá con mayor severidad, así que preste atención a la proporción del lisado a la muestra. La operación centrífuga 4C conduce a una eliminación más completa de proteínas. Otro uso de la extracción con PC es usar fenol ácido para eliminar parcialmente el ADN y obtener ARN con un mínimo de residuos de ADN durante la extracción de ARN. Sin embargo, una cosa para recordar es que algunas muestras de plantas no se pueden extraer con PC antes de que se eliminen algunas impurezas, de lo contrario, el ácido nucleico se degradará.
El método de precipitación de proteína / alcohol de precipitación con alto contenido de sal también es un método muy bueno. En comparación con el método de extracción de PC, este método casi supera todas las deficiencias de la extracción de PC, excepto que la estabilidad de la pureza puede ser menor. El beneficio de una eliminación de proteínas más rápida y sencilla es que se puede utilizar para la extracción a gran escala, pero la desventaja es que la pureza (residuo de proteína) no es lo suficientemente estable. La eficiencia de precipitación de la proteína es mejor a 4ºC.
El método de purificación de medios es un método que ha recibido cada vez más atención. Su característica más importante es que es muy adecuado para la extracción de ácidos nucleicos a gran escala y, dado que no se ve afectado por factores humanos, la estabilidad de la pureza es alta. Su talón de Aquiles es la cantidad excesiva de muestra. El medio se puede dividir en dos categorías, una es de tipo columna, es decir, el medio está precargado en la columna que se encuentra debajo; el otro tipo es granular. La operación de purificación del medio granular no es muy diferente de la clásica precipitación con alcohol. Es a través del proceso de agregar líquido y verter líquido varias veces. Después del secado, el ácido nucleico purificado se puede obtener disolviéndolo.
Aunque la operación de purificación de columna también tiene el proceso de agregar líquido y verter líquido, porque el líquido agregado ingresará a otro tubo de centrífuga después de la centrifugación, y se separa completamente de la columna que contiene ácido nucleico, por lo que el lavado es más completo y la operación ahorra más trabajo. Sin embargo, el costo del método de purificación de medios es el más alto.
