核酸纯化技术有哪些？

目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类：使用介质的和不使用介质的，使用介质的，一次就将核酸与其它所有杂质分开；不使用介质的，一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开，再通过沉淀核酸使核酸与盐分开。

1）经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术

细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 体积) 混合液。依据应用目的，两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸) 或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸) 后离心分离。疏水性的蛋白质被分配至有机相，核酸则被留于上层水相。酚是一种有机溶剂，预先要用STE 缓冲液饱和，因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联；故在制备酚饱和液时要加入一特殊物质，以防止酚氧化。氯仿可去除脂肪，使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。

核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀，在含核酸的水相中加入p H5. 0～5.5 ，终浓度为0.3M的NaAc 或KAc 后，钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中促进核酸的疏水复性。然后加入2～2. 5 倍体积的乙醇,经一定时间的孵育，可使核酸有效地沉淀。其他的一些有机溶剂（异丙醇、聚乙二醇( PEG) 等）和盐类(10. 0mol/ L 醋酸铵、8. 0mol/ L 的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等) 也用于核酸的沉淀。

2）使用离子交换介质的纯化技术

将裂解液过柱，核酸被联结在离子交换介质上；洗涤去除残留的杂质后，用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。再经过标准的乙醇/异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥等操作，获得纯的核酸，溶解于合适的缓冲液中。

3）使用吸附介质的纯化技术

将裂解液过柱，核酸被吸附介质选择性吸附；洗涤去除残留的杂质后，用水或者合适的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来，就可以直接用于后续实验。

4) 密度梯度离心法

密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。双链DNA、单链DNA、RNA 和蛋白质具有不同的密度，因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带，该法适用于大量核酸样本的制备，其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA 的首选方法。氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合，离心后形成的核酸区带经紫外灯照射，产生荧光而被检测，用注射针头穿刺回收后，通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。

纯化方法评价

PC(P是英文酚的缩写，C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法，是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。PC抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。虽然每次 PC 抽提都会损失一部分核酸 (因为不可能将水相全部移取)，以及低浓度核酸的醇沉淀效率低，但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。苯酚能使蛋白质变性，变性后的蛋白质从水相中被析出，处于苯酚中或者苯酚/水相之间。PC 抽提的关键是，一要混匀彻底，二要用量足够。彻底混匀，才能确保苯酚与蛋白质的充分接触，使蛋白质完全变性。许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸，尤其是基因组 DNA 造成破坏，实际上大可不必如此小心。剧烈的混匀操作，是会部分打断大分子的基因组 DNA，但该破坏作用不会强烈到 DNA 变成 10kb 以内的小片段。手剧烈晃动混匀后，基因组 DNA 的片段，大部分会大于 20kb，这个大小，除了一些特别的要求外，对 PCR 和酶切，都是完全适用的。如果要求的片段非常大，如构建文库用，则不能使用剧烈的混匀方法，而只能来回温和颠倒混匀。

此时的关键是：裂解液的比例要足够大，使体系不要太粘稠。用量要足够，是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。超过了该饱和度，裂解体系中的蛋白质不会被一次去除，必须靠多次抽提，方可彻底去除。另外，体系太粘稠的坏处是，蛋白质难以彻底去除，以及基因组 DNA 会断裂得更厉害，所以要注意裂解液与样品的比例。4C离心操作有利于更彻底去除蛋白质。PC 抽提的另外一个用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA 的特点，在 RNA 抽提时获得 DNA 残留极少的 RNA。不过有一点要提醒的是，有些植物样品，在去除某些杂质之前，是不能使用 PC 抽提的，否则核酸必定降解。

高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。蛋白质的沉淀效率在 4C 会更好一些。

介质纯化方法，是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状。颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大，都是通过数次的加液-倒液过程，干燥后，溶解即可获得纯化好的核酸。柱式纯化的操作虽然也是有加液倒液过程，但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中，与含有核酸的柱子完全是分开的，所以洗涤更彻底，操作更省力。不过，介质纯化方法的成本是最高的。