Какие существуют методы экстракции нуклеиновых кислот?
Нуклеиновая кислота — носитель генетической информации, важнейшая молекула биологической информации и главный объект исследований молекулярной биологии. Таким образом, экстракция нуклеиновой кислоты является наиболее важной и основной операцией в экспериментальной технологии молекулярной биологии.
Нуклеиновая кислота делится на дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). РНК можно разделить на рибосомную РНК (рРНК), информационную РНК (мРНК) и транспортную РНК (тРНК) в соответствии с их функциями.
ДНК в основном сосредоточена в ядре, митохондриях и хлоропластах, в то время как РНК в основном распределена в цитоплазме.
В нуклеиновых кислотах пуриновые и пиримидиновые основания имеют конъюгированные двойные связи, поэтому нуклеиновые кислоты обладают характеристиками поглощения ультрафиолета. Ультрафиолетовое поглощение натриевой соли ДНК составляет около 260 нм, а ее поглощение представлено как A260. Он находится в впитывающем желобе на 230 нм, поэтому можно использовать ультрафиолетовую спектроскопию. Фотометр выполняет количественное и качественное определение нуклеиновых кислот.
Нуклеиновая кислота — это амфотерный электролит, который эквивалентен поликислоте. Нейтральный или щелочной буфер можно использовать для диссоциации нуклеиновой кислоты на анионы, которые помещаются в электрическое поле и движутся к аноду. Это принцип электрофореза.
Принципы и требования экстракции и очистки нуклеиновых кислот
1. Обеспечить целостность первичной структуры нуклеиновой кислоты;
2. Устранение загрязнения от других молекул (например, устранение вмешательства РНК при извлечении ДНК);
3. Не должно быть органических растворителей и высоких концентраций ионов металлов, которые могут ингибировать ферменты в образцах нуклеиновых кислот;
4. Сведите к минимуму макромолекулярные вещества, такие как белки, полисахариды и липиды, насколько это возможно.
Тип экстракции нуклеиновой кислоты
1. Извлечение общей РНК
Из общей РНК 75-85% составляет рРНК (в основном 28S-26S / 23S и 18S / 16S рРНК), а остальная часть состоит из мРНК и малых РНК с разными молекулярными массами и нуклеотидными последовательностями, такими как тРНК, 5S рРНК, 5,8S. рРНК, миРНК, миРНК, малая ядерная РНК (малая ядерная РНК, мяРНК) и малая ядрышковая РНК (малая ядерная РНК, мяРНК) и другие компоненты.
2. извлечение miRNA
МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие высококонсервативные молекулы РНК, такие как малые интерферирующие РНК (миРНК), которые регулируют экспрессию своих гомологичных молекул мРНК путем спаривания с ними оснований для предотвращения экспрессии с помощью различных механизмов. Они стали ключевым органом регулирования развития, пролиферации, дифференциации и клеточного цикла клеток.
3. Извлечение геномной ДНК
Для исследования структуры и функции генов и диагностики генов обычно требуется, чтобы длина полученного фрагмента была не менее 100-200kb. В процессе выделения ДНК следует избегать различных факторов, вызывающих фрагментацию и деградацию ДНК, насколько это возможно, чтобы гарантировать целостность ДНК и заложить основу для последующих экспериментов.
4. Экстракция плазмиды
Метод экстракции плазмиды заключается в удалении РНК, отделении плазмиды от бактериальной геномной ДНК и удалении белков и других примесей для получения относительно чистой плазмиды.
Метод экстракции и очистки нуклеиновых кислот
1. Метод экстракции фенолом / хлороформом.
Изобретенный в 1956 году после обработки фенолом / хлороформом жидкости для дробления клеток или гомогената ткани, компоненты нуклеиновых кислот, состоящие в основном из ДНК, растворяются в водной фазе, а липиды в основном содержатся в органической фазе, а белки находятся между двумя фазами.
2. Метод осаждения спиртом.
Этанол может устранить гидратный слой нуклеиновой кислоты и обнажить отрицательно заряженные фосфатные группы. Положительно заряженные ионы, такие как NA ﹢, могут объединяться с фосфатными группами с образованием осадка.
3. Метод хроматографической колонки.
Благодаря специальному адсорбционному материалу с кремниевой матрицей ДНК может специфически адсорбироваться, а РНК и белок могут проходить через нее плавно, а затем использовать высокую соль и низкий pH для связывания нуклеиновой кислоты, а также элюирование с низким содержанием соли и высоким pH для разделения и очистки нуклеиновой кислоты.
4. Щелочной метод термического крекинга.
Щелочная экстракция в основном использует топологическую разницу между ковалентно закрытыми кольцевыми плазмидами и линейным хроматином для их разделения. В щелочных условиях денатурированные белки растворимы.
5. Метод кипячения и крекинга.
Нагрейте раствор ДНК, чтобы использовать характеристики линейных молекул ДНК для отделения фрагментов ДНК от осадка, образованного денатурированными белками и клеточными остатками, центрифугированием.
6. Метод наномагнитных шариков.
Поверхность суперпарамагнитных наночастиц модифицируется и модифицируется с помощью нанотехнологий для получения наномагнитных шариков из суперпарамагнитного оксида кремния. Магнитные шарики могут специфически распознавать и эффективно объединяться с молекулами нуклеиновой кислоты на микроскопической поверхности раздела. Используя суперпарамагнетизм наносфер кремнезема, под действием хаотропных солей (гидрохлорид гуанидина, изотиоцианат гуанидина и др.) И внешнего магнитного поля ДНК и РНК отделяются от крови, тканей животных, продуктов питания, патогенных микроорганизмов и других образцов.
7. Другие методы
В дополнение к вышеупомянутым обычно используемым методам существует множество методов, таких как ультразвук, многократное замораживание и оттаивание, ферментативный гидролиз и гипотонический лизис.
