Какие существуют технологии очистки нуклеиновых кислот?
В настоящее время технологии очистки нуклеиновых кислот, широко используемые в научных исследованиях, можно разделить на две категории: те, которые используют среды, и те, которые не используют среды. Если используется среда, нуклеиновая кислота одновременно отделяется от всех других примесей; если среда не используется, первым делом нужно отделить нуклеиновую кислоту от всех других примесей. Нуклеиновая кислота и соль отделяются от макромолекулярных примесей, а нуклеиновая кислота отделяется от соли путем осаждения нуклеиновой кислоты.
1) Классическая технология очистки с использованием экстракции фенол / хлороформ
После лизирования клеток водную фазу, содержащую нуклеиновую кислоту, отделяют центрифугированием и добавляют равный объем смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (объем 25: 24: 1). В соответствии с целью применения две фазы встряхивают и смешивают (подходит для разделения нуклеиновых кислот с малой молекулярной массой) или просто переворачивают и смешивают (подходит для разделения нуклеиновых кислот с высокой молекулярной массой), а затем центрифугируют. Гидрофобные белки разделяются на органическую фазу, а нуклеиновые кислоты остаются в верхней водной фазе.
Фенол — органический растворитель. Его следует предварительно пропитать буфером STE. Ненасыщенный фенол поглотит водную фазу и заберет часть нуклеиновой кислоты. Фенол также легко окисляется и желтеет, а окисленный фенол может вызывать разрыв или сшивание цепи нуклеиновой кислоты фосфодиэфирной связью в цепи нуклеиновой кислоты; поэтому при приготовлении насыщенного раствора фенола следует добавить специальное вещество, чтобы предотвратить окисление фенола. Хлороформ может удалять жир и денатурировать больше белка, тем самым повышая эффективность экстракции. Изоамиловый спирт может уменьшить образование пузырьков во время работы.
Соль нуклеиновой кислоты может быть осаждена некоторыми органическими растворителями, нуклеиновая кислота может быть сконцентрирована осаждением, тип буфера растворения нуклеиновой кислоты может быть изменен, а некоторые молекулы примесей могут быть удалены. Типичным примером является осаждение этанолом после экстракции фенолом и хлороформом. После добавления pH от 5,0 до 5,5 в водную фазу, содержащую нуклеиновую кислоту, конечная концентрация NaAc или KAc при конечной концентрации 0,3 М нейтрализует ионы натрия на фосфатном скелете нуклеиновой кислоты. Отрицательный заряд способствует гидрофобному ренатурации нуклеиновых кислот в кислой среде. Затем добавьте в 2–2,5 раза больше этанола, после определенного периода инкубации нуклеиновая кислота может эффективно осаждаться. Некоторые другие органические растворители (изопропанол, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и т. Д.) И соли (10,0 моль / л ацетата аммония, 8,0 моль / л хлорид лития, хлорид магния и хлорид цинка низкой концентрации и т. Д.) Также используются для осаждение нуклеиновых кислот.
2) Технология очистки с использованием ионообменных сред
Лизат пропускают через колонку, и нуклеиновая кислота связывается с ионообменной средой; после промывки для удаления остаточных примесей нуклеиновая кислота элюируется из среды высокосолевым буфером. После стандартного осаждения этанолом / изопропанолом, промывки этанолом, сушки и других операций получают чистую нуклеиновую кислоту и растворяют в подходящем буфере.
3) Технология очистки с использованием адсорбционных сред
Лизат пропускают через колонку, и нуклеиновая кислота селективно адсорбируется адсорбционной средой; после промывки для удаления остаточных примесей нуклеиновая кислота элюируется из среды водой или подходящим малосолевым буфером, и ее можно непосредственно использовать в последующих экспериментах.
4) Центрифугирование в градиенте плотности
Центрифугирование в градиенте плотности также используется для разделения и анализа нуклеиновых кислот. Двухцепочечная ДНК, одноцепочечная ДНК, РНК и белок имеют разную плотность, поэтому чистые зоны образца разной плотности могут быть сформированы центрифугированием в градиенте плотности. Этот метод подходит для приготовления большого количества образцов нуклеиновых кислот, в которых центрифугирование в градиенте веретена в градиенте хлорида цезия и 2 этилбромида считается предпочтительным методом очистки больших количеств плазмидной ДНК. Хлорид цезия является стандартной средой для центрифугирования в градиенте плотности нуклеиновых кислот. Бромид этидия в градиентном растворе соединяется с нуклеиновой кислотой. Зона нуклеиновой кислоты, образованная после центрифугирования, облучается ультрафиолетовой лампой для получения флуоресценции и обнаружения. Диализ или осаждение этанолом удаляют хлорид цезия с получением очищенной нуклеиновой кислоты.
Оценка методов очистки
PC (P — аббревиатура от английского phenol, C — это аббревиатура от английского хлороформа) метод экстракции / осаждения спиртом — это метод, который никогда не устареет. Стабильно, надежно, экономично и удобно. Экстракция ПК может полностью удалить белки, а осаждение спиртом может удалить соли. Для обычных чистых образцов (примеси — белки) этим методом можно полностью получить высококачественные нуклеиновые кислоты. Хотя при каждой экстракции ПК будет потеряна часть нуклеиновой кислоты (поскольку невозможно удалить всю водную фазу), а низкая концентрация нуклеиновой кислоты спиртом, эффективность осаждения низка, но эти проблемы могут быть решены с помощью рабочих настроек или уменьшения влияние.
Самая большая проблема этого метода в том, что он не подходит для крупномасштабной добычи. Экстракция ПК — очень эффективное средство для удаления белка. Фенол может денатурировать белок, и денатурированный белок отделяется от водной фазы, в феноле или между фазой фенол / вода. Ключом к извлечению ПК является тщательное перемешивание и использование достаточного количества. Тщательное перемешивание может обеспечить достаточный контакт между фенолом и белком и полностью денатурировать белок. Многие люди всегда беспокоятся о том, не вызовет ли сильное смешение повреждений нуклеиновых кислот, особенно геномной ДНК. На самом деле, не нужно быть настолько осторожным.
Операция интенсивного перемешивания частично нарушит геномную ДНК больших молекул, но повреждение не будет настолько сильным, чтобы ДНК превратилась в небольшой фрагмент в пределах 10 килобайт. После энергичного встряхивания и перемешивания большая часть фрагментов геномной ДНК будет больше 20 килобайт. Этот размер, за исключением некоторых особых требований, полностью подходит для ПЦР и рестрикционного расщепления. Если требуемые фрагменты очень большие, например, для создания библиотеки, вы не можете использовать метод интенсивного перемешивания, а только осторожно перевернуть и перемешать взад и вперед.
Ключевым моментом на данном этапе является то, что соотношение раствора для лизиса должно быть достаточно большим, чтобы система не была слишком вязкой. Количество должно быть достаточным, потому что фенол имеет определенную степень насыщения для удаления белка. Если насыщение превышено, белок в системе лизиса не будет удален за один раз, и его необходимо экстрагировать несколько раз, прежде чем его можно будет полностью удалить. Кроме того, недостатком слишком вязкой системы является то, что белок трудно удалить полностью, а геномная ДНК будет разрушена сильнее, поэтому обратите внимание на соотношение лизата к образцу. Центробежная операция 4C способствует более тщательному удалению белка. Другое применение экстракции ПК — использование кислого фенола для частичного удаления ДНК и получения РНК с минимальным остатком ДНК во время экстракции РНК. Однако следует напомнить, что некоторые образцы растений нельзя экстрагировать с помощью ПК до того, как будут удалены некоторые примеси, в противном случае нуклеиновая кислота будет разлагаться.
Метод осаждения белок / спирт с высоким содержанием соли также является очень хорошим методом. По сравнению с методом экстракции ПК этот метод почти преодолевает все недостатки экстракции ПК, за исключением того, что стабильность чистоты может быть ниже. Преимущество более быстрого и легкого удаления белка заключается в том, что его можно использовать для крупномасштабной экстракции, но недостатком является то, что чистота (остаток белка) недостаточно стабильна. Эффективность осаждения белка выше при 4 ° C.
Метод очистки среды — метод, которому уделяется все больше и больше внимания. Его самая большая особенность заключается в том, что он очень подходит для крупномасштабной экстракции нуклеиновых кислот, и, поскольку на него не влияют человеческие факторы, стабильность чистоты высока. Его ахиллесова пята — чрезмерное количество пробы. Среду можно разделить на две категории: первая — тип столбца, то есть среда предварительно заполняется в столбце под ним; другой тип — гранулированный. Операция очистки гранулированной среды мало чем отличается от классического осаждения спиртом. Это процесс добавления жидкости и переливания жидкости несколько раз. После сушки очищенную нуклеиновую кислоту можно получить путем ее растворения.
Хотя операция очистки колонки также включает процесс добавления жидкости и заливки жидкости, потому что добавленная жидкость попадет в другую центрифужную пробирку после центрифугирования, и она полностью отделена от колонки, содержащей нуклеиновую кислоту, поэтому промывка будет более тщательной, а операция более трудосберегающий. Однако стоимость метода очистки среды самая высокая.
